[發明專利]一種IBMI注射胎肝Ficoll分離單細胞懸液以重建造血的方法

在審

• 申請號: 201810979803.4
• 申請日: 2018-08-27
• 公開（公告）號: CN109182267A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 曾凡一;黃淑幀;楊冠恒
• 申請（專利權）人: 上海市兒童醫院;上海滔華生物醫藥科技合伙企業（有限合伙）
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;A61K35/28;A61P7/00;A61P7/06
• 代理公司: 北京文苑專利代理有限公司 11516
• 代理人: 喬志員

本發明公開了一種IBMI注射胎肝Ficoll分離單細胞懸液以重建造血的方法。通過胎肝單細胞懸液制備，胎肝HSCs移植的操作步驟，本發明的方法能高效重建血液系統，造血安全、穩定、可靠，且能高質量地對地貧小鼠進行有效治療，治療后的血液學參數，病理學指標接近于正常個體，這對于未來臨床開發胎肝造血干進行血液性等疾病的高效治療儲備了技術體系基礎。

技術領域

本發明屬于造血干細胞制備技術領域，具體涉及一種IBMI注射胎肝Ficoll分離單細胞懸液以重建造血的方法。

背景技術

造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)是可自我更新并能向各系血細胞分化的一類細胞。HSCs移植可對惡性血液病、遺傳代謝性疾病和先天性免疫缺陷等相關疾病進行治療。目前造血干細胞的來源主要是骨髓HSCs和臍帶血HSCs，但供體細胞來源緊張，致使可受治患者的數量極其有限，因此探尋新型的可移植造血干細胞具有迫切的臨床需求性。HSCs除了個體體內獲取，其它研究較多的是通過多能性干細胞體外分化形成，或通過體細胞的轉分化形成。但體外分化或轉分化方式目前均不能有效的得到具有移植造血重建功能的HSCs。這是因為在胚胎發育過程中，造血細胞如何形成？在其形成的調控機制還未闡明。8.5-9.5d小鼠胚胎卵黃囊的造血島開始發生原始造血，隨后造血區域轉移至主動脈-性腺-中腎，其它的研究則發現這一時期的胎盤、頭部和臍動脈中也出現造血干細胞。10.5d后胎肝造血開始發生，16d后，胎肝造血逐漸向骨髓髓內造血變化。劉兵團隊在胚胎早期成功地獲得了造血干細胞前體(pre-HSC)，并經分析鑒定，CD201為這類細胞的表面標記，隨后他們與蘭雨課題組今年在cell research雜志上首次揭示出在在小鼠胚胎發育的過程中，AGM區HSCs及其前體細胞的功能具有異質性，這種功能不同的細胞具有時空差異特征，其中淋系髓系平衡型(β型)具有較高的自我更新能力和造血重建潛能，這些突破性的研究為探尋胚胎發育早期主要功能性造血重建的HSCs類型及造血干相關的再生醫學提供了理論論據。13.5天胎齡的小鼠胎肝中含有豐富不同分化階段的肝干細胞、HSCs和間充質干細胞，相比較骨髓HSCs，其造血體系可能含有增殖分化潛能更強的HSCs，且整個體系的免疫原性和免疫活性更低。且由于其造血區域相對集中，因此研究胚胎期髓外造血、挖掘具有造血功能作用的胎肝細胞，以及分析微環境支持細胞對于造血形成和造血維持的調控作用，對于進一步分析造血形成機制及造血干細胞的開發應用均有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種IBMI注射胎肝Ficoll分離單細胞懸液以重建造血的方法。

一種IBMI注射胎肝Ficoll分離單細胞懸液以重建造血的方法，按照如下步驟進行：

(1)胎肝單細胞懸液制備：取哺乳動物胎肝，用槍頭打碎成單細胞，細胞濾器過濾，除去細胞團塊，用Ficoll分離液分離出單核細胞；

(2)胎肝HSCs移植：配置單核細胞懸液，通過骨髓腔內注射方法，對受體進行骨髓腔內注射。

所述哺乳動物為人，鼠，猴，?；蜓?。

所述單核細胞懸液的注射量為1×10⁵/20ul-1×10⁷/20ul。

本發明的有益效果：本發明用密度梯度離心法，分離獲得的紅系高表達GFP的轉基因小鼠13.5天胎肝或WT小鼠的單核細胞作為供體細胞，采用IBMI移植方法，對¹³⁷Cs照射的野生型小鼠進行造血系統重建的研究。移植7天后，熒光鏡檢小鼠骨髓涂片和血液涂片可觀察到GFP+的細胞，表明供體細胞已經隨著骨髓和血液系統的被運輸到全身各處，并有效地向血系細胞分化。通過血涂片周期性鏡檢觀察，可能看到HS23胎肝供體細胞在第5周外周血GFP熒光細胞最多，說明造血此時或之前形成高峰，說明造血功能開始穩定。為有效治療α或β地中海貧血、骨髓障礙性貧血、重癥免疫缺陷等疾病開辟了新的方案。

附圖說明