[發明專利]一種度拉魯肽中多種修飾水平的檢測方法

有效

• 申請號: 201810978150.8
• 申請日: 2018-08-27
• 公開（公告）號: CN110865129B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 安振明;李道遠;劉飛飛;殷振豪;劉傳磊;王亞寧;王希菊;孫麗霞
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于IdeS酶切的度拉魯肽中多種修飾水平的分析方法，其特征在于，步驟如下：

(1)在待測度拉魯肽樣品中加入酶切緩沖液形成緩沖體系，混勻后加入IdeS蛋白酶進行酶切；

(2)酶切完畢后加入巰基還原試劑對樣品中的二硫鍵進行還原；

(3)采用液相色譜串聯質譜法對樣品進行分析；

所述步驟(1)的緩沖體系中度拉魯肽的終濃度為0.5μg/μL，所述步驟(1)中IdeS酶量為1μg度拉魯肽加入1Unit，IdeS的酶切溫度為37℃，酶切過夜；所述步驟(1)的酶切緩沖液為50mM磷酸鹽+150mM NaCl，pH6.6；

所述步驟(2)的巰基還原試劑為三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)，終濃度為10mM，處理溫度為37℃，處理時間為15min；

所述步驟(3)中液相色譜串聯質譜法所采用的液相色譜柱為C₄反相色譜柱，其中，流動相A為0.1％甲酸/水溶液，流動相B為0.1％甲酸/乙腈溶液；流動相B比例為15％，平衡2min后，8min內線性升高至50％；

所述步驟(3)中液相色譜串聯質譜法所使用的串聯質譜為Waters公司的ESI-Q-TOF，關鍵質譜參數設定如下：采用正離子模式進行采集；毛細管電壓：+2.5kV；錐孔電壓：60V；離子源溫度：120℃；去溶劑氣溫度：400℃；錐孔氣流速：50L/h；去溶劑氣流速：800L/h；所得數據采用UNIFI 1.8工作站進行處理；

所述的多種修飾包括：絲氨酸磷酸化、賴氨酸羥化、葡萄糖基半乳糖羥賴氨酸修飾、甲醛修飾和乙醛修飾。