[發明專利]一種抗豬產腸毒素大腸桿菌卵黃抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201810974583.6
• 申請日: 2018-08-24
• 公開（公告）號: CN109608541B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 賀平麗;韓帥娟;楊豐帆;楊硯;譙仕彥;李德發
• 申請（專利權）人: 湖北神地農業科貿有限公司;湖北神地生物科技有限公司;湖北神地匯豐生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/02;A61K39/40;A61P1/12;A61P31/04;A23K20/147
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 田芳

1.一種抗豬產腸毒素大腸桿菌的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，以混合抗原免疫蛋雞，獲得卵黃抗體，所述混合抗原包含三價腸毒素融合蛋白和K88天然菌毛；

所述三價腸毒素融合蛋白是LTB蛋白-柔性連接序列₁-STa蛋白-柔性連接序列₁-STb蛋白，所述柔性連接序列₁的氨基酸序列為SGGGGSGGGGSGGGG；

所述混合抗原進一步含有K88全菌滅活苗；

所述混合抗原以液體形式存在，其中，每毫升含有三價腸毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，K88全菌滅活苗1.0×10⁹-5.0×10⁹cfu；

卵黃抗體的提取方法為聚乙二醇沉淀，所述聚乙二醇沉淀提取卵黃抗體包括如下步驟：將卵黃與緩沖液混合后，加入聚乙二醇使其終濃度為2-5W/V％，攪拌后離心，取上清過濾，濾液中加入聚乙二醇使其終濃度為7-10W/V％，攪拌后離心，沉淀物用緩沖液溶解，加入聚乙二醇使其終濃度為10-15W/V％，攪拌后離心，沉淀物用緩沖液溶解并透析；

所述三價腸毒素融合蛋白的制備包括如下步驟：1)構建帶有融合蛋白基因的質粒載體；2)轉化宿主細菌；3)誘導表達目的蛋白；4)提取純化目的蛋白；

所述步驟4)提取純化目的蛋白，進一步包含以下步驟：離心收集菌體細胞，破碎菌體收集包涵體，裂解包涵體，采用親和層析柱純化目的蛋白，透析以使變性的目的蛋白復性；其中，采用鎳親和層析柱純化目的蛋白，先用結合緩沖液清洗柱子除去雜蛋白，同時平衡柱子，然后以洗脫緩沖液洗脫并收集洗脫液，所述洗脫緩沖液的組成為：15-25mM pH 7.2-7.6PB緩沖液，含0.4-0.6M NaCl、350-450mM咪唑和7-9M尿素；所述結合緩沖液的組成為：15-25mM pH 7.2-7.6PB緩沖液，含0.4-0.6M NaCl、15-25mM咪唑和7-9M尿素。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述混合抗原中，三價腸毒素融合蛋白和K88天然菌毛的質量比為1:2～2:1。

3.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量為，三價腸毒素融合蛋白為每只雞每次0.25-0.75mg；K88天然菌毛為每只雞每次0.25-0.75mg；K88全菌滅活苗為每只雞每次1.0×10⁹-5.0×10⁹cfu。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量為，三價腸毒素融合蛋白為每只雞每次0.5mg。

5.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量為，K88天然菌毛為每只雞每次0.5mg。

6.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量為，K88全菌滅活苗為每只雞每次2.5×10⁹cfu。

7.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，將混合抗原和佐劑混合免疫蛋雞，所述佐劑是弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，混合抗原和弗氏完全佐劑的體積比為2:1～1:2；混合抗原和弗氏不完全佐劑的體積比為2:1～1:2。

8.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙二醇沉淀提取卵黃抗體包括如下步驟：將卵黃與緩沖液混合后，加入聚乙二醇使其終濃度為3.2-3.8W/V％，攪拌后離心，取上清過濾，濾液中加入聚乙二醇使其終濃度為8.2-8.8W/V％，攪拌后離心，沉淀物用緩沖液溶解，加入聚乙二醇使其終濃度為11.5-12.5W/V％，攪拌后離心，沉淀物用緩沖液溶解并透析。

9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙二醇為PEG2000～PEG6000。