[發明專利]一種酶法制備β-羥基-β-甲基丁酸的方法

有效

• 申請號: 201810972633.7
• 申請日: 2018-08-24
• 公開（公告）號: CN108866017B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 范文超;高書良;王金剛;梁巖;袁圣倫;任亮
• 申請（專利權）人: 浙江華睿生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明通過定向進化的方法獲得了一種高酶活力的糖多孢紅霉菌細胞色素P450氧化酶突變體，該突變體或者其表達微生物能高效催化β?甲基丁酸進行羥基化反應生成β?羥基?β?甲基丁酸，作為底物的β?甲基丁酸濃度可以達到10g/L，24小時轉化后，轉化率達到70％以上，具有工業應用前景。

技術領域

本發明屬于生物催化領域，涉及一種酶法制備β-羥基-β-甲基丁酸的方法，具體地說，涉及一種糖多孢紅霉菌細胞色素P450氧化酶突變體及其在制備β-羥基-β-甲基丁酸中的用途。

背景技術

β-羥基-β-甲基丁酸(3-Hydroxy-3-methylbutyrate Hydrate，HMB)是無色晶體，分子式為C₅H₁₀O₃，結構式為：

HMB的鈣鹽是一種營養補劑，可以在運動員耐力訓練中防止肌肉損傷、肌蛋白斷裂，也可作為減肥食品的有效成分；可促進動物生長、減少脂肪、增加瘦肉，保證動物健康。該化合物在1995年通過美國GRAS認證，推薦使用量≤3g/天，市場潛力巨大。

在人和動物體內的天然代謝途徑中，β-羥基-β-甲基丁酸可經由支鏈氨基酸代謝途徑中的亮氨酸(leucine)降解的中間產物α-KIC(α-ketosiocaproate)生成(Miyazaki,T.,A.,et al.SpringerPlus,4(1):494.)。目前HMB主要依賴化學合成法進行制備，例如主要是以次氯酸鈉、二丙酮醇、鹽酸、乙酸乙酯、乙醇、氫氧化鈣為反應原料，經過氧化合成、酸化、萃取、中和反應、離心、干燥等步驟制得。但是，化學合成法存在著有機溶劑、腐蝕性酸等試劑使用量大、廢料污染嚴重等無法克服的缺陷，使得化學合成法受到環境保護政策的嚴重管控和限制，承受著巨大的環保壓力。

近些年來，尋找綠色環保的HMB制備途徑已經成為研究熱點，相對應的生物合成法日益受到業內青睞。目前研究得HMB生物法主要是利用Galactomyces reessii菌體細胞發酵、同步流加底物β-甲基丁酸進行生物催化來制備HMB(Lee,I.Y.andJ.P.N.Rosazza.Archives of Microbiology.1998,169(3):257-262.Lee,I.Y.,S.L.Nissen and J.P.Rosazza.Applied and Environmental Microbiology.1997,63(11):4191-4195.)。但是，該方法存在反應產物組分復雜、后期分離純化困難等問題。

目前還未有利用單一原料為底物、通過一步酶催化來制備HMB的方法。這成為本發明要實現的目標。

發明內容

為了尋找催化效率高、產物后處理更容易的生物催化法來制備HMB，本發明選擇以糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)來源的細胞色素P450氧化酶EryK作為研究目標。該酶EryK的天然功能為：在氧氣參與下，以NADPH為輔因子，催化底物紅霉素D(Erythromycin D)分子的甲基碳原子C-12發生羥基化反應(Zhang,H.,Y.Wang,J.Wu,K.Skalina and B.A.Pfeifer.ChemistryBiology.2010,17(11):1232-1240.)。細胞色素P450氧化酶又稱為P450酶、單加氧酶、多功能氧化酶、羥化酶。本發明的研究對象為來源于糖多孢紅霉菌的P450氧化酶EryK，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1，選用的編碼基因為SEQ IDNO:2。以EryK為基礎，通過易錯PCR的方法建立EryK基因突變庫，再通過篩選基因突變庫獲得活力明顯提高的P450氧化酶。

因此，本發明的一個目的在于提供一種P450氧化酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3：