[發明專利]一種犬早孕檢測試劑條的制備及使用方法

在審

• 申請號: 201810963056.5
• 申請日: 2018-08-22
• 公開（公告）號: CN109061135A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 李來慶
• 申請（專利權）人: 廣州藝佳生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/558;G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 東莞市神州眾達專利商標事務所(普通合伙) 44251
• 代理人: 陳世洪

1.一種犬早孕檢測試劑條的制備，其特征在于包括如下步驟：

S1：樣本墊的處理：將樣本墊置于含有1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN3的0.02mol/LPB緩沖液中，浸泡3min后放置在60℃真空干燥箱中充分干燥備用；

S2：熒光微球結合墊的制備：將RLN標記的熒光納米微球和雞IgG標記的熒光納米微球，使用上海金標噴金劃膜儀噴在熒光結合墊上，35℃干燥過夜處理；

S3：T、C線的制備：使用抗體稀釋液(pH7.4的PBS緩沖液和體積比為0.05％Proclin300組成)對山羊IgG和RLN包被抗體R014進行稀釋，使用噴金劃膜儀均勻噴在NC膜的質控線和檢測線上，兩線距離5mm，噴完后35℃干燥過夜備用；

S4：試劑條組裝：將樣本墊、結合墊、NC膜、吸水紙依次搭接地粘貼在PVC底板上，用切條機切成4.0mm寬的試紙條，置于有干燥劑的錫箔袋中密封保存。

2.根據權利要求1所述的一種犬早孕檢測試劑條的制備，其特征在于：所述熒光納米微球通過使用粒徑200nm銪離子熒光微球，抗體標記使用的是EDC和NHS活化微球上的羧基，活化后的羧基與蛋白上的氨基結合使Eu-CM偶聯上蛋白，參照微球說明書進行標記，抗體微球按照質量比為1：10進行標記實驗，用0.05mol/l嗎啉乙磺酸緩沖液(MES)離心洗滌銪離子熒光微球2次，按照每毫克微球分別加入等質量的EDC和NHS，室溫下震蕩反應30min，12000g離心去除上清(以除去多余的EDC和NHS)，使用MES緩沖液清洗沉淀2次，按量加入檢測抗體E001，室溫震蕩反應2h，12000g離心去除上清，用pH7.5PBS緩沖液洗滌沉淀2次并復溶于PBS緩沖液中，然后加入封閉緩沖液(由0.05mol/l Tris、5％牛血清白蛋白(w/v)、0.05％Triton X-100(v/v)和0.09％疊氮化鈉(w/v)組成，封閉緩沖液的pH值為7.5)進行封閉，4℃封閉過夜，使用PBS洗滌2次，4℃保存備使用。

3.根據權利要求1所述的一種犬早孕檢測試劑條的制備，其特征在于：所述檢測抗體E001與包被抗體R014通過將純化的犬松弛素與載體蛋白KLH交聯，以常規方法與福氏佐劑混合后免疫Balb/C小鼠，50微克/只，2周/次，經過5次皮下免疫后，測定效價在1：320000以上，分離脾臟，與骨髓瘤細胞進行融合，以純化的犬松弛素為抗原，間接ELISA法篩選松弛素單克隆抗體，用競爭抑制法對獲得的特異性克隆進行配對，篩選得到配對抗體的檢測抗體E001和包被抗體R014。

4.根據權利要求3所述的一種犬早孕檢測試劑條的制備，其特征在于：所述犬松弛素通過將松弛素B肽鏈和A肽鏈分別在N端添加大腸桿菌蛋白信號肽設計成分泌肽鏈，在同一表達載體于大腸桿菌膜外周間隙分泌表達，并在膜外周間隙的氧化環境中形成B肽鏈和A肽鏈間的二硫鍵，自組裝成成熟的犬松弛素。

5.根據權利要求3所述的一種犬早孕檢測試劑條的使用方法，其特征在于：使用抗原稀釋液(PBS緩沖液+1％BSA+0.5％Tween20)稀釋血清樣本，震蕩混勻，取100μl血清混懸液，加入檢測卡的加樣孔中，10分鐘后通過熒光檢測儀分別檢測T、C線位置的熒光信號，儀器將T、C位置的熒光信號換算成數字信息，并計算出T、C位置熒光信號強度的比值，用ELISACalc軟件繪制標準曲線。