[發(fā)明專利]一種馬鈴薯Y病毒弱毒株、載體、制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810951010.1
• 申請日: 2018-08-20
• 公開（公告）號: CN110857437A
• 公開（公告）日: 2020-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李向東;程林發(fā);劉茜;萬秀清;田延平;李現(xiàn)道;郭思達;耿超;喬嬋;李若
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué);中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/82;C12R1/01
• 代理公司: 北京元中知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11223
• 代理人: 另婧

本發(fā)明涉及植物抗病毒基因工程領(lǐng)域，公開了一種馬鈴薯Y病毒弱毒株、載體、制備方法及其應(yīng)用。馬鈴薯Y病毒弱毒株系中，HC?Pro基因的氨基酸序列的第182位的賴氨酸突變?yōu)榫彼帷C?Pro的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，HC?Pro的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。本發(fā)明通過定點突變的方式獲得了一種致病力明顯降低的馬鈴薯Y病毒弱毒株突變體，該弱毒株突變體可以起到有效的交叉保護作用，顯著減輕植物受馬鈴薯Y病毒強毒株系感染后的傷害，延遲植物發(fā)病，大大減少損失。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物抗病毒基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種馬鈴薯Y病毒弱毒株、載體、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

病毒病是作物上的重要病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。由于作物病毒病種類多，傳播途徑復(fù)雜，生產(chǎn)上沒有免疫或高抗病毒病的品種，市場上又沒有對病毒病特效的藥劑，因而病毒病的防治非常困難。

馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，寄主范圍較廣，可侵染馬鈴薯、煙草、番茄和辣椒在內(nèi)的多種茄科作物，造成巨大的經(jīng)濟損失。

目前關(guān)于PVY株系劃分的研究較多。根據(jù)其在煙草上的癥狀，PVY分為引起葉脈壞死的壞死株系(PVYN)和引起花葉的普通株系(PVYO)，其中壞死株系可導(dǎo)致煙葉絕產(chǎn)，在生產(chǎn)中的危害更重。因此，PVY尤其是N株系是威脅煙葉安全生產(chǎn)的重要問題。受限于卷煙企業(yè)和生產(chǎn)需要，僅有的幾個抗病毒煙草品種不能廣泛種植，市場上又沒有對病毒病特效的藥劑，煙草病毒病的防治非常困難。因此，交叉保護是防治煙草病毒病的一種有效方式。交叉保護是指植株受弱毒株系侵染后，免受后繼的病毒強毒株系侵染的現(xiàn)象，已經(jīng)在許多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保護廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素是可用的弱毒株系太少。

目前關(guān)于PVY弱毒株系的研究很少。有研究證明了HC-Pro蛋白的C末端的氨基酸K400和E419是決定煙草葉脈壞死的關(guān)鍵位點。但也有一些PVY分離物，其HC-Pro蛋白中同時存在K400和E419兩個氨基酸殘基，但不會誘導(dǎo)煙草出現(xiàn)葉脈壞死癥狀。這表明，K400和E419兩個氨基酸殘基不是決定煙草葉脈壞死的唯一決定因素，除了此之外還可能有其它決定因子的存在。因此，急需能夠起到有效交叉保護作用的弱毒株系來防治植物的病毒病。

有鑒于此特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種馬鈴薯Y病毒弱毒株、載體、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過定點突變的方式獲得了一種致病力明顯降低的馬鈴薯Y病毒弱毒株突變體，同時該弱毒株突變體可以起到有效的交叉保護作用，顯著減輕植物受馬鈴薯Y病毒強毒株系感染后的傷害，延遲植物發(fā)病，大大減少損失。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用技術(shù)方案的基本構(gòu)思是：

本發(fā)明的第一目的是提供一種馬鈴薯Y病毒弱毒株系，其特征在于，馬鈴薯Y病毒弱毒株系中，HC-Pro基因的氨基酸序列的第182位的賴氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

進一步的方案，突變前，HC-Pro的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，HC-Pro的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。

本發(fā)明的第二目的是提供一種含有如上所述的馬鈴薯Y病毒弱毒株系基因組的載體。

進一步的方案，載體以pCAMBIA0390為基礎(chǔ)，插入馬鈴薯Y病毒弱毒株系基因組，且HC-Pro基因的氨基酸序列的第182位的賴氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

本發(fā)明的第三目的是提供一種如上所述的一種馬鈴薯Y病毒弱毒株系，或者如上所述的載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)利用PCR定點突變將馬鈴薯Y病毒的輔助成分-蛋白酶HC-Pro的第182位氨基酸賴氨酸突變?yōu)榫彼幔?/p>