[發明專利]一種用于檢測魚源創傷弧菌金屬蛋白酶基因的引物以及熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201810947950.3
• 申請日: 2018-08-20
• 公開（公告）號: CN109097484A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 胡秀彩;呂愛軍;王英杰;孫敬鋒
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 王雨杰

本發明提供了一種用于檢測魚源創傷弧菌金屬蛋白酶基因的引物以及熒光定量PCR檢測方法，所述引物的核苷酸序列如下所示：上游引物VVPF：CCTGGTTTCTCGGGTGCTG；下游引物VVPR：TGGTATGCCGTTGACTCTTTGA。本發明所述的用于檢測魚源創傷弧菌金屬蛋白酶基因的引物以及熒光定量PCR檢測方法為創傷弧菌感染的早期檢測與快速鑒定、組織親嗜性研究、流行病學調查等方面，提供一種特異、敏感和成本較低的檢測方法。為魚源創傷弧菌感染的早期診斷、快速鑒定及臨床應用奠定基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，尤其是涉及一種用于檢測魚源創傷弧菌金屬蛋白酶基因的引物以及熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

創傷弧菌的毒力因子有溶細胞毒素、金屬蛋白酶、莢膜多糖、鞭毛及 RTX毒素，與菌體致病性密切相關。許多學者已經對它們的致病機制進行了廣泛的研究(Oliver etal.1986)。在已有報道中，各毒力因子在創傷弧菌感染過程中發揮重要作用，通過不同的途徑發揮其致病作用，對宿主造成損害 (武靜等2015；王明義和胡成進2017)。

一直以來，創傷弧菌在水產養殖行業的報道很多，有過報道的動物有皺紋盤鮑(馬健民等1996)、石鰈魚(沈志強等2001)、軍曹魚(簡紀常等 2003)、大菱鲆(于蘭萍等2008)和矛尾復蝦虎魚(馬愛敏等2008)、黃姑魚(畢可然2011)、羅非魚(黎炯等2011)和矛尾復蝦虎魚(畢可然等 2011)等。創傷弧菌病表現癥狀因品種不同而不同，無典型病理變化，因此給臨床診斷造成了很多的困擾。創傷弧菌對水產養殖業危害嚴重，造成了較大的經濟損失，已經受到了廣大水產疾病研究者的特殊關注與重視。

金屬蛋白酶(Metalloprotease)即VVP，是菌株唯一分泌至細胞外的蛋白酶，是一種較強的毒力因子(FAN et al.2011)。對人體內的大部分蛋白質具有廣泛的蛋白酶活性，能分解膠原蛋白和彈性蛋白(Miyoshi et al.1995) 進而導致組織壞死以及皮膚損害，可激活血漿中的緩激肽進而引起血管通透性增強，出現局部水腫或大皰。緩激肽的生產也是創傷弧菌感染后機體的重要特征性表現之一(Wang et al.2008)。

水產病原菌分離鑒定主要采用傳統的生理生化鑒定法，分子生物學方法和免疫學方法進行檢測。其中生理生化鑒定法配合分子生物學方法仍是重要的致病弧菌檢測手段。血清學檢測是采用特異性抗體與抗原發生血清學反應，以確定病原菌的種類。間接熒光抗體的技術(秦啟偉等1995)和雙抗夾心ELISA檢測法(王崇明等1999)這兩種方法都是免疫學為基礎的血清學檢測法在創傷弧菌檢測的實際應用，檢測靈敏度高，最低細菌檢測數為 1×10⁴CFU/mL。但以上方法程序復雜，耗時費工。

近幾年水產品檢疫中，TaqMan探針法已經得到了廣泛的應用，創傷弧菌vvhA基因序列設計的引物和探針進行實時熒光定量PCR檢測，潘軍航等 (2010)已經建立了檢測創傷弧菌TaqMan探針法，靈敏度達1.4CFU/mL。但前期工作復雜，需要設計特異性的TaqMan探針，價格昂貴。

實時熒光定量PCR技術(Real-time Fluorescent Quantitative PCR，RT-PCR /q-PCR)是一種新的核酸定量技術。程曉艷等(2010)利用該染料已經建立 qPCR檢測對蝦白斑綜合癥病毒方法，并且對試驗結果的特異性進行了專門的闡述。但對魚源創傷弧菌金屬蛋白酶基因，q-PCR技術尚未見相關應用。