[發明專利]基于染色質重塑激活內源性Pdx1基因表達的方法

有效

• 申請號: 201810947480.0
• 申請日: 2018-08-20
• 公開（公告）號: CN109097400B
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發明（設計）人: 王啟偉;葉華虎
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N5/071
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了基于染色質重塑激活內源性Pdx1基因表達的方法。本發明提供了一種激活靶細胞中內源性Pdx1基因表達的方法，是基于CRISPR?on的SAM系統建立激活靶細胞中內源性Pdx1基因表達的方法。所述SAM系統包括靶向Pdx1基因轉錄起始點上游?400至+1bp位置的sgRNA，所述sgRNA的靶序列為SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4。本發明應用CRISPR?on技術，通過染色質重塑，能夠高效地激活293T細胞的Pdx1表達。本研究將對基因誘導PSCs定向分化為β細胞以及胰腺的胚胎發育研究具有重要作用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及基于染色質重塑激活內源性Pdx1基因表達的方法。

背景技術

糖尿病的發病率正在逐年顯著增加。2017年WHO報告顯示，目前全球糖尿病的發病率約為8.5％，大約有4.22億糖尿病患者。1型糖尿病是由于胰島β細胞受到自身免疫反應攻擊所導致的。當殘存的胰島β細胞數量少于胰島細胞總數的10-20％就會表現出臨床癥狀[Gillespie,K.M.Type 1diabetes:pathogenesis and prevention.CMAJ 175,165-170,doi:10.1503/cmaj.060244(2006).]。2型糖尿病是由于細胞增殖能力下降和細胞凋亡增加而導致β細胞功能異常和進行性細胞數量減少[Joost,H.G.Pathogenesis,riskassessment and prevention of type 2diabetes mellitus.Obes Facts 1,128-137,doi:10.1159/000137673(2008).]。目前，胰島β細胞移植被認為是治療糖尿病最有效的辦法之一。然而，大規模胰島β細胞移植的應用卻受到細胞來源短缺和終生使用免疫抑制劑等限制[Atkinson,M.A.Eisenbarth,G.S.Type 1diabetes:new perspectives on diseasepathogenesis and treatment.Lancet 358,221-229,doi:10.1016/S0140-6736(01)05415-0(2001).]。多能干細胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，具有自我更新和多向分化潛能。因此，PSCs成為糖尿病的細胞治療的理想細胞來源。近年來，PSCs定向分化為胰島β細胞和非胰島β細胞轉分化的研究取得了較大的進展[Miyazaki,S.,Yamato,E.Miyazaki,J.Regulated expression of pdx-1promotes invitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stemcells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]。目前誘導細胞分化為胰島素分泌細胞的方法主要包括兩類：一是采用調控胰島β細胞發生特異性轉錄因子法；另一是生長因子和小分子化合物組合法。基因誘導方法主要是采用胰島細胞發生過程中的關鍵性轉錄因子誘導細胞分化與轉分化。Miyazaki等采用Tet off系統構建了誘導表達Pdx1的ES細胞系，結果顯示Pdx1能夠提高生長因子和小分子化合物法誘導ESCs向β細胞分化的效率，增強分化細胞相關基因的表達，如insulin 2、somatostatin、Kir6.2、glucokinase、neurogenin3、p48、Pax6、PC2和HNF6[Miyazaki,S.,Yamato,E.Miyazaki,J.Regulated expression of pdx-1promotesin vitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stemcells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]。Kubo等的研究結果表明，過表達Pdx1和Ngn3能夠顯著上調內胚層細胞表達insulin和胰島相關基因[Kubo,A.et al.Pdx1and Ngn3overexpression enhances pancreatic differentiation of mouse ES cell-derivedendoderm population.PLoS One 6,e24058,doi:10.1371/journal.pone.0024058(2011).]。表達Pdx1的腺病毒感染人皮膚角質細胞，能迅速激活胰腺發生相關的特異性轉錄因子，將細胞誘導分化為胰島素分泌細胞。這些轉分化細胞在葡萄糖刺激下具有合成和分泌胰島素的功能[Mauda-Havakuk,M.et al.Ectopic PDX-1expression directlyreprograms human keratinocytes along pancreatic insulin-producing cellsfate.PLoS One 6,e26298,doi:10.1371/journal.pone.0026298(2011).]。Zhou等發現Pdx1，Ngn3和MafA在小鼠體內可將胰腺外分泌部細胞轉化為胰島β細胞。這些轉化的細胞與內源性的胰島β細胞非常相似，表達胰島β細胞功能相關基因，能夠分泌胰島素，降低小鼠的血糖[Zhou,Q.,Brown,J.,Kanarek,A.,Rajagopal,J.Melton,D.A.In vivoreprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.Nature 455,627-632,doi:10.1038/nature07314(2008).]。Akinci等采用了同樣的方法，觀察了體外Pdx1，Ngn3和MafA對大鼠胰腺外分泌細胞系AR42j-B13的轉分化作用。盡管轉分化所獲得的細胞表達胰島素，降低糖尿病小鼠的血糖水平；但細胞內源性的Pdx1，Ngn3和MafA沒有被激活，且不表達胰島β細胞功能相關的一些基因。因此，這些細胞的轉分化是不完全的[Akinci,E.,Banga,A.,Greder,L.V.,Dutton,J.R.Slack,J.M.Reprogramming ofpancreatic exocrine cells towards a beta(beta)cell character using Pdx1,Ngn3and MafA.Biochem J442,539-550,doi:10.1042/BJ20111678(2012).]。基因誘導分化的方法具有特異性強，操作相對容易，成本較低。然而，目前外源基因過表達的方法很難激活內源性相關基因的表達，因此，分化的細胞不具有成熟的生理功能。胚胎發育中各譜系的細胞分化是受譜系特異性轉錄因子精確調控，最終分化為各胚層的終末分化細胞。與此同時，細胞分化過程中各種轉錄因子的活化是受表觀遺傳學各種調控機制控制的。表觀遺傳學因素與各種轉錄因子相互協調作用，形成適合于特定譜系分化的微環境，才能有效保證機體各種細胞的正常分化。表觀遺傳學在細胞功能中的重要作用可從細胞重編程過程中得到佐證。由成纖維細胞重編程至iPSCs的過程，影響重編程效率的一個重要因素就是表觀遺傳學障礙。Huangfu等的研究顯示，DNA甲基轉移酶和組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠顯著提高細胞重編程的效率。尤其是組蛋白去乙酰化酶抑制劑valproic acid(VPA)能夠將重編程效率提高100倍[Huangfu,D.et al.Induction of pluripotent stem cells by definedfactors is greatly improved by small-molecule compounds.Nat Biotechnol26,795-797,doi:10.1038/nbt1418(2008).]。近期，Ding小組通過CRISPR(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)技術重置染色質Oct4和Sox2位點的表觀遺傳狀態，激活內源性Oct4和Sox2的表達，成功地重編程成纖維細胞至iPSCs[Liu,P.,Chen,M.,Liu,Y.,Qi,L.S.Ding,S.CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the EndogenousOct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency.Cell Stem Cell 22,252-261e254,doi:10.1016/j.stem.2017.12.001(2018).]，這進一步顯示了表觀遺傳在細胞功能中的重要作用。