[發明專利]一種基于小反芻獸疫病毒受體的細胞BHK/slam

在審

• 申請號: 201810942657.8
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN109266614A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 吳錦艷;田宏;尚佑軍;曹小安;惠小婷;劉湘濤;劉永生
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

1.一種基于小反芻獸疫病毒受體的細胞BHK/slam，保藏編號為：CCTCC NO:C201895。

2.根據權利要求1所述的一種基于小反芻獸疫病毒受體的細胞BHK/slam，其特征在于所述小反芻獸疫病毒受體完整ORF翻譯后的蛋白序列為：

SEQ ID NO.1:MDHKGLLSSNVLLFFSLIIELSCRTGEGLTSSTK

TIRGQLGSSVLLPLASEEISRSMNKSIHILVTMAESPRDTVKKKIVSLDLRKGDSPRLEDGYEFHLENLSLRILKSRKEDEGWYFISLEENVSVQHFSLQLKLYEQVSTPQIKVLNSTQEDGNCSLMLACVVEKGDHVTYNWSEEAGAPLLSPTNSSHLLYLTLGPQRANNVYICIASNPISNSSQTFIPWSRCSSRPPESRQWGLYTGLFLGGIVGVIMILQVVILLLRRRGKTDNYQPTMEAKSLTIYAQVQKSGSVKKRPDPLPAQDPCTTIYVAATEPVPEPIQESGSFTVYASVTVPES。

3.根據權利要求1所述的一種基于小反芻獸疫病毒受體的細胞BHK/slam，其特征在于采用SEQ ID NO.1，通過構建慢病毒表達載體，獲得復制缺陷型慢病毒，以獲得的慢病毒上清感染BHK細胞，篩選表達slam完整ORF的BHK細胞克隆并驗證其對小反芻獸疫病毒復制的增強效果。

4.根據權利要求1或2所述的一種基于小反芻獸疫病毒受體的細胞BHK/slam，其特征在于構建所述小反芻獸疫病毒受體表達骨架的克隆載體為pDONR^TM221P5-P2(2-fragment)，表達載體為pLenti4/V5-DEST^TM Vector；與上述克隆載體和表達載體匹配的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3：

SEQ ID NO.2:

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTA

ATGGATCACAAAGGGCTCCTCTCCT，

SEQ ID NO.3:

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTT

CAGCTCTCTGGAACCGTCACA。

5.根據權利要求3所述的一種基于小反芻獸疫病毒受體的細胞BHK/slam，其特征在于所述表達骨架共轉染293-FT細胞進行包裝，選用100平米細胞瓶，于750ul opti-MEM中分別加入表達骨架、pLP1、pLP2及VSV-G質粒的量均為12-15ug；感染靶標細胞BHK時感作時間為1-3h；篩選穩轉細胞，使BHK細胞死亡的blasticidin S-HCl殺稻瘟菌素的最低濃度為3.0ug/ml。

6.根據權利要求2或4所述的一種基于小反芻獸疫病毒受體的細胞BHK/slam，其特征在于所述細胞BHK/slam/v采用下述方法進行驗證：靶標基因擴增；Western-Blot免疫印跡；致細胞病變效應及實時熒光定量計算相對拷貝數。