[發(fā)明專利]一種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白檢測試劑盒及其制備方法和使用方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810942522.1
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN109212181A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王赟;劉振世;石慧;程云燕;江川;劉振國
• 申請（專利權(quán)）人: 泰州澤成生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

1.一種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒內(nèi)包括熒光素標(biāo)記的NGAL抗體溶液、堿性磷酸酶標(biāo)記的NGAL抗體溶液、包被熒光素抗體的磁微粒懸浮液、NGAL校準(zhǔn)品和發(fā)光底物溶液；

所述熒光素標(biāo)記的NGAL抗體溶液是將NGAL抗體加入到含有熒光素的pH為7-9的Tris-HCl緩沖液反應(yīng)制備而成；

所述堿性磷酸酶標(biāo)記的NGAL抗體溶液由堿性磷酸酶與NGAL抗體通過交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯連接而成；

所述包被熒光素抗體的磁微粒懸浮液是將熒光素抗體與含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒混合反應(yīng)而成；

所述NGAL校準(zhǔn)品是將NGAL抗原溶解到校準(zhǔn)品緩沖溶液中配制而成，所述校準(zhǔn)品緩沖溶液是通過在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四環(huán)素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后經(jīng)過0.22μm濾膜處理制備而成；

所述發(fā)光底物溶液是將發(fā)光底物溶解于含有Tris、氯化鈉(NaCl)、亞硫酸鈉(Na2SO3)和Proclin-300的底物中配制而成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白檢測試劑盒，其特征在：

所述熒光素標(biāo)記的NGAL抗體溶液濃度為0.8-1.2μg/mL，pH為7-9；

所述堿性磷酸酶標(biāo)記的NGAL抗體溶液濃度為0.5-0.8μg/ml，pH為7-9。

3.一種如權(quán)利要求1或2所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)制備所述熒光素標(biāo)記的NGAL抗體溶液：

(1-1)配制含有熒光素的pH為7-9的Tris-HCl緩沖液，所述緩沖液中含有4-8wt％的聚乙二醇6000(PEG-6000)、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.08-0.1wt％的疊氮鈉、0.6wt％的ProClin-300、0.8-1wt％的牛血清白蛋白和20mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)；

(1-2)按照所述熒光素與所述NGAL抗體分子比為150:1的比例，將步驟(1-1)中pH為7-9緩沖液與NGAL抗體混合，充分混勻，室溫靜置反應(yīng)；

(1-3)將步驟(1-2)中的反應(yīng)液通過G-25凝膠柱分離未結(jié)合的熒光素，得到含熒光素標(biāo)記的NGAL抗體溶液；

(2)制備所述堿性磷酸酶標(biāo)記的NGAL抗體溶液：

(2-1)使用二甲基亞砜溶劑將NGAL抗體溶解，使溶解后的NGAL抗體濃度為30-60mg/mL，加入交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯混合均勻，置于室溫反應(yīng)2-3小時(shí)；取適量二甲基亞砜溶劑對NGAL抗體與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物進(jìn)行稀釋，使稀釋后的二甲基亞砜溶劑和NGAL抗體與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物的體積比為1:10，并將得到混合溶液置于2-8℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

(2-2)按照堿性磷酸酶與步驟(2-1)中交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:2的量將濃度為1-2mg/mL的堿性磷酸酶緩沖液加入步驟(2-1)中的混合溶液并混合均勻，室溫放置反應(yīng)1.5h；

(2-3)將步驟(2-2)中的反應(yīng)液通過G-25凝膠柱除鹽，即得所述堿性磷酸酶標(biāo)記的NGAL抗體溶液；

(3)制備所述包被熒光素抗體的磁微粒懸浮液：

(3-1)在偶聯(lián)劑碳二亞胺的環(huán)境下，將含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體混合均勻，室溫放置反應(yīng)10-20h，磁分離，除上清液，即得到所述包被熒光素抗體的磁微粒懸浮液；

(4)制備所述NGAL校準(zhǔn)品：

(4-1)配制校準(zhǔn)品緩沖溶液：在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四環(huán)素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后經(jīng)過0.22μm濾膜處理制備而成；

(4-2)用所述校準(zhǔn)品緩沖溶液溶解NGAL抗原，即得所述NGAL校準(zhǔn)品；

(5)制備所述發(fā)光底物溶液：

(5-1)取Tris 2g、氯化鈉(NaCl)6g、亞硫酸鈉(Na₂SO₃)0.005g和Proclin-300 0.5mL于燒杯中，加入600mL純化水，充分?jǐn)嚢杌靹蛑寥芙猓{(diào)節(jié)pH至7.5；加200mL發(fā)光底物，用0.2μm濾器過濾，純化水定容至1000mL，混勻即得所述發(fā)光底物溶液。