[發明專利]用于長讀長高質量測序的核酸文庫的構建方法、測序方法及試劑

有效

• 申請號: 201810941818.1
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN110835783B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 楊乃波;李新洋;項海濤;廖莎;徐崇鈞;許軍強
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/11;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了一種用于長讀長高質量測序的核酸文庫的構建方法、測序方法及試劑，所述方法包括：以核酸作為起始模板材料進行第一次擴增，其中正向引物由5’端至3’端依次包括公共序列、唯一分子識別標記序列以及與模板結合的序列，反向引物是目標特異性序列或非特異性序列；以第一次擴增的產物為模板進行第二次擴增，包括在各自獨立體系中進行的正向文庫擴增和反向文庫擴增；以及以第二次擴增的產物為模板進行第三次擴增。本發明的方法將唯一分子識別標記技術與定向加正反測序接頭形成正反雙向文庫技術結合起來，根據測序重疊部分拼接出高質量的數據，從而實現長讀長測序。本發明對多種平臺具有廣泛的適用性，適用于單端測序和雙端測序策略。

技術領域

本發明涉及測序技術領域，尤其涉及一種用于長讀長高質量測序的核酸文庫的構建方法、測序方法及試劑。

背景技術

長PCR產物文庫的高通量測序，如16S?rRNA細菌鑒定、基于高通量測序的HLA分型以及免疫組庫測序等，在科學研究中經常遇到。以免疫組庫可變區全長文庫(主峰300bp至600bp)為例，一般采用Illumina公司的PE250(Hiseq)或者PE300(Miseq)測序方式。所使用的進口測序儀器和測序試劑價格都很昂貴，購買貨期較長，并且保質期較短。同時，對于PCR產物的雙末端高通量測序策略而言，PE250或者PE300測序模式下的讀長2(Reads2)的末端100bp質量值迅速下降(Q30從70-80％以上下降至50％以下)。而國產測序儀目前還不能做到對主峰300bp至600bp插入片段序列的高質量測序。對單末端測序來講，能保證前300bp堿基的高質量值，Q30大于等于70％～80％，大于300bp時堿基質量值迅速下降。但是國產測序儀器和試劑價格相對便宜，貨期短，因此若能開發出基于國產測序儀的長PCR產物的建庫和測序策略，將具有很大競爭優勢。

發明內容

本發明一種用于長讀長高質量測序的核酸文庫的構建方法、測序方法及試劑。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種核酸文庫的構建方法，該方法包括：

(a)以DNA或RNA作為起始模板材料進行第一次擴增，上述第一次擴增中使用的引物包括正向引物和反向引物，其中上述正向引物由5’端至3’端依次包括一段公共序列、一段唯一分子識別標記序列以及一段與模板結合的序列，上述反向引物是目標特異性序列或非特異性序列；

(b)以上述第一次擴增的產物為模板，進行第二次擴增，上述第二次擴增包括在各自獨立體系中進行的正向文庫擴增和反向文庫擴增，上述正向文庫擴增中使用的引物包括第一引物和第二引物，上述第一引物由5’端至3’端依次包括部分測序接頭序列A和上述公共序列，上述第二引物由5’端至3’端依次包括部分測序接頭序列B和目標特異性序列；上述反向文庫擴增中使用的引物包括第三引物和第四引物，上述第三引物由5’端至3’端依次包括上述部分測序接頭序列B和上述公共序列，上述第四引物由5’端至3’端依次包括上述部分測序接頭序列A和上述目標特異性序列；以及

(c)以上述正向文庫擴增和反向文庫擴增的產物為模板，進行第三次擴增，上述第三次擴增中使用的引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物包括位于3’端的上述部分測序接頭序列A及其上游序列，該上游序列包括用于區分樣本的條形碼序列，上述反向引物包括位于3’端的上述部分測序接頭序列B及其上游序列。

優選地，上述起始模板材料是DNA，上述第一次擴增使用的正向引物中與模板結合的序列是一段特異性序列，上述第一次擴增使用的反向引物是目標特異性序列。

優選地，上述起始模板材料是RNA，上述第一次擴增使用的正向引物是模板轉換寡核苷酸(TSO)，上述模板轉換寡核苷酸中與模板結合的序列包括位于3’端的鎖核酸(LNA)，上述第一次擴增使用的反向引物是隨機引物或oligo-dT引物。