[發(fā)明專利]一種通過環(huán)狀單鏈探針制備長探針的方法及其在基因芯片生產(chǎn)中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810941697.0
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號(hào): CN109055488B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡偉文;侯巖松;顏飛地;鄧佳
• 申請（專利權(quán)）人: 中山康源基因技術(shù)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6837
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞;裘暉

本發(fā)明公開了一種通過環(huán)狀單鏈探針制備長探針的方法及其在基因芯片生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過將探針和擴(kuò)增接頭連接成環(huán)，或是探針自身連接成環(huán)，得到環(huán)狀單鏈探針；對環(huán)狀單鏈探針擴(kuò)增，得到直鏈單鏈的長探針。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：擴(kuò)增所得探針長度極佳，可達(dá)10000nt以上；探針擴(kuò)增長度與擴(kuò)增時(shí)間近似線性關(guān)系，到批量操作時(shí)，同批次探針長度均一，雜交信號(hào)更均勻；擴(kuò)增所得探針產(chǎn)量極高，約為直接連接法的幾十倍，且省去反復(fù)磷酸化、連接反應(yīng)流程，節(jié)省大量生物酶的使用和制備時(shí)間。因此，本發(fā)明特別適合在基因芯片生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種探針的制備方法，特別涉及一種通過環(huán)狀單鏈探針制備長探針的方法及其在基因芯片生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

基因芯片，又稱DNA芯片，是基于DNA分子雜交原理制造的一種生物芯片。通過與一組已知序列的核酸探針雜交，進(jìn)行核酸序列測定、定性和定量檢測。固定于基片表面已知序列的靶核苷酸，稱為探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸分子，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，可通過熒光信號(hào)的強(qiáng)度和位置確定檢測核酸的序列和含量。基因芯片可同時(shí)對大量的核酸分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測和分析。

基因芯片具有廣泛的應(yīng)用，包括疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防、航天等許多領(lǐng)域。幫助人類認(rèn)識(shí)生命的起源、遺傳、發(fā)育與進(jìn)化過程，為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設(shè)計(jì)和藥物開發(fā)中先導(dǎo)化合物的快速篩選和藥物基因組學(xué)研究提供技術(shù)支持平臺(tái)。

目前，基因芯片有兩種主要類型，點(diǎn)樣法和原位合成法。點(diǎn)樣法是使用自動(dòng)化微量點(diǎn)樣裝置將預(yù)先制備好的探針點(diǎn)印在玻璃板上，通過化學(xué)修飾的方法固定在對應(yīng)的位置上。這種方法的點(diǎn)陣密度范圍可從數(shù)百至幾萬，各個(gè)探針在表面的結(jié)合量也比較一致，是一種成本較低且訂制靈活的方法。但這種方法的點(diǎn)陣密度較原位合成法仍有差距。原位合成法是應(yīng)用微電子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)，在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列。這種方法探針密度極高，可達(dá)十萬級別，但訂制成本極高，靈活性不及點(diǎn)樣法。其次，采用每個(gè)探針分子通過一個(gè)化學(xué)鍵的方式與基材結(jié)合，所以也存在效率低，背景信號(hào)高的缺點(diǎn)。

因此，人們在制備芯片的時(shí)候，都希望用較低的成本得到靈敏度較高的芯片。國家發(fā)明專利“高特異性高靈敏度的基因芯片及其制備方法與應(yīng)用”(CN 102168146 B)提供了一種基因芯片的制備方法，將每個(gè)探針分子通過多個(gè)化學(xué)鍵與基材表面結(jié)合，大大增加了探針的穩(wěn)定性和降低了背景噪聲的影響。但這種方法對探針長度要求較高，一方面，如果探針長度過短，多個(gè)化學(xué)鍵的固定會(huì)使得探針固結(jié)于基材表面，使得雜交效率低或無法雜交；另一方面，探針長度短，為兼顧雜交特異性和雜交效率，對于固定探針的化學(xué)修飾劑的濃度配比要求則極為苛刻，如果探針長度足夠長則有比較寬泛的比例范圍可選擇，便于大批量的操作。該專利中描述的探針制備技術(shù)是通過兩步完成，首先，對化學(xué)合成的短的探針序列進(jìn)行5’磷酸化；然后，在一個(gè)短的輔助接頭序列的幫助下，進(jìn)行連接反應(yīng)，使短的探針序列頭尾相接成長序列。這種做法仍然存在一定缺陷。因?yàn)樵谶B接反應(yīng)進(jìn)行過程中，所有探針分子及輔助接頭分子的堿基都是以單鏈的形式開放著的，對于大量的不同的探針序列，難以避免他們自身或之間相互作用，形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響連接效率。這嚴(yán)重制約了該方法的廣泛應(yīng)用。同時(shí)，因?yàn)橐l(fā)生多個(gè)連接反應(yīng)，探針分子才能連接足夠長度，這對連接酶的活性和用量以及反應(yīng)時(shí)間和溫度等條件的要求都較高。連接的探針直接用于芯片生產(chǎn)，對化學(xué)合成的短探針和制備各環(huán)節(jié)酶用量的消耗都較高，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過環(huán)狀單鏈探針制備長探針的方法。

本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提供上述通過環(huán)狀單鏈探針制備長探針的方法在基因芯片生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種通過環(huán)狀單鏈探針制備長探針的方法，包括如下步驟：

(1)通過方案(A)或(B)獲得環(huán)狀單鏈探針；