[發明專利]用于催化木質纖維素糖化的纖維小體酶制劑

有效

• 申請號: 201810939532.X
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN108976302B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 崔球;劉亞君;李仁民;劉世岳;祁寬;馮銀剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/24;C12N9/26;C12N9/50;C12P19/14;C12P19/00
• 代理公司: 山東康裕律師事務所 37311
• 代理人: 傅培

針對現有技術中纖維小體在木質纖維素糖化中所存在的問題，本發明提供了用于催化木質纖維素糖化的纖維小體酶制劑。所述纖維小體酶制劑是通過非纖維小體蛋白與纖維小體中的組分相互作用，將非纖維小體蛋白結合在纖維小體中而獲得的蛋白復合體；然后將其用于糖化，即糖化過程沒有細菌細胞的參與。本發明所述的纖維小體酶制劑，不但實現了其穩定性和活性的維持，而且大大提升了其與體系中其他酶的協同作用，從而降低了酶的消耗量，降低了生產成本和工藝的繁瑣性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種酶制劑，具體涉及一種用于催化木質纖維素糖化的纖維小體酶制劑。

背景技術

木質纖維素是一類供應豐富且環境友好的可再生物質，是唯一可大規模再生且全面替代化石能源的資源，大力發展木質纖維素原料在能源等領域的利用，是加快發展循環經濟，保障國家能源安全和碳減排的一項重要戰略任務。然而，木質纖維素轉化的最大瓶頸莫過于纖維素結晶區難降解、導致酶解效率低，成本高。因此，要實現木質纖維素的高效利用，就必須首先實現該不溶性復雜底物的高效水解糖化。目前，木質纖維素糖化主要是通過依賴于真菌游離酶纖維素降解酶系的工藝來實現。這些工藝中酶的成本占木質纖維素生物轉化過程總成本的50％左右，且經過幾十年的努力仍不能有效降低其用酶成本。此外，木質纖維素的水解效率也是重要的限制因素。因此，需要轉換思路，開發不同于游離纖維素酶系的新型酶制劑實現木質纖維素的高效利用。

已知纖維小體是熱纖梭菌等厭氧細菌生產的一種具有復雜結構和組分的多酶復合體，是自然界中已知的最高效的纖維素降解體系之一。纖維小體包括腳架蛋白等非催化單元以及具有不同催化活性的酶單元，并通過多級腳架蛋白和不同纖維小體酶類具有的多類型組裝模塊間特異性的非共價相互作用，將不同的功能組分組裝成為分子量超過兆道爾頓的超分子多酶復合體。纖維小體組分和結構還具有時空調控特性，以適應木質纖維素的復雜成分，從而保證了其高效降解活力。此外，纖維小體還通過腳架蛋白或纖維素酶上所具有的纖維素結合模塊和掛壁模塊與底物及細胞組成三元復合體，纖維小體和細胞間的協同作用可以進一步提高了木質纖維素的糖化效率(專利文件EP2013355)。

盡管纖維小體及其生產菌株在木質纖維素糖化應用中具有巨大潛力，但其工業化應用仍受到多種因素的限制。例如，纖維二糖對纖維小體酶有嚴重的反饋抑制作用。針對這一問題，前人主要通過向水解體系里額外添加β-1,4-葡萄糖苷酶等非纖維小體蛋白來提高纖維小體的活力和對底物的適應力。然而，由于外源添加的蛋白的活性及穩定性會隨著糖化過程的進行而降低，因此，酶的消耗需要提高酶添加量或添加次數。此外，這些非纖維小體蛋白作為游離酶添加到糖化體系中，不能與纖維小體相互作用，會顯著降低與體系中其他酶的協同作用，不可避免造成大于需求量的酶的額外添加，導致酶制劑成本的居高不下。不僅如此，這種依賴于外源添加游離酶的糖化策略，工藝復雜，對設備要求高，轉化效率還不能滿足工業化生產要求。

研究人員此前的工作發現，通過在熱纖梭菌中表達β-1,4葡萄糖苷酶可以提高熱纖梭菌降解微晶纖維素的能力(Zhang,J.,S.Liu,R.Li,W.Hong,Y.Xiao,Y.Feng,Q.Cui andY.-J.Liu(2017).Efficient whole-cell-catalyzing cellulose saccharificationusing engineered Clostridium thermocellum.Biotechnol Biofuels 10(1):124.)，這一工作解決了纖維二糖對纖維小體酶有嚴重的反饋抑制作用的問題，同時解決了將非纖維小體蛋白作為游離酶添加到糖化體系中存在的成本高等問題。但是，該工作是以微晶纖維素這一純纖維素為底物，所提供的酶制劑以及添加β-1,4葡萄糖苷酶的方法并不能解決木質纖維素糖化中遇到的其他問題。例如，由于木質纖維素的成分復雜(包括纖維素、半纖維素、果膠、淀粉、蛋白質、木質素等)非纖維素成分會與纖維素成分交聯在一起，這一復雜結構會降低纖維素酶與纖維素底物的可及性，從而降低糖化效率。另外，纖維素酶會非特異性的吸附在木質纖維素的復雜成分中，從而大大降低糖化效率。此外，向纖維小體中加入其他酶仍然存在能否在細胞內表達，能否分泌到胞外，能否組裝到纖維小體內，能否與纖維小體組分產生協同作用從而促進糖化等問題。