[發明專利]采用木質纖維素培養微藻的方法

有效

• 申請號: 201810939294.2
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN108977401B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 崔球;劉亞君;祁寬;宋曉金
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/22
• 分類號: C12N1/22;C12N1/12;C12N1/20
• 代理公司: 山東康裕律師事務所 37311
• 代理人: 傅培

1.采用木質纖維素培養微藻的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）預處理：對木質纖維素原料進行預處理，得到木質素含量不高于20%，半纖維素含量不高于25%的木質纖維素底物；

（2）糖化：按照固液重量體積比1:2-1:25將步驟（1）得到的木質纖維素底物轉移至厭氧發酵罐的糖化培養基中，將纖維素酶制劑加入所述木質纖維素底物中，在34-65℃的溫度條件進行水解反應，得到含有葡萄糖的糖液；所述纖維素酶制劑通過非纖維小體蛋白與纖維小體中的組分相互作用，將非纖維小體蛋白結合在纖維小體復合體中得到；所述纖維小體為由熱纖梭菌生產且分泌在胞外的具有木質纖維素降解活性的多酶復合體；

其中，所述非纖維小體蛋白具體為：由基因組CP001393.1中1968724至1973904核酸序列編碼的纖維素外切酶Cel9-48、編碼序列為SEQ ID NO: 2的膨脹因子Epn、編碼序列為SEQID NO: 1的木聚糖酶XynA和由基因組CP001393.1中2531445至2532785核酸序列編碼的果膠酶PelA；

其中，所述纖維素外切酶Cel9-48的3’端與熱纖梭菌的I型對接模塊DocIct的序列SEQID NO: 6直接連接；所述膨脹因子Epn與腳架蛋白SdbA的5’端進行融合表達，所述腳架蛋白SdbA的序列為基因組CP002416.1中1108113至1109912核酸序列編碼；所述木聚糖酶XynA的3’端與II型粘連模塊CohII的序列SEQ ID NO: 7直接連接；所述果膠酶PelA的3’端與熱纖梭菌的I型對接模塊DocIct的序列SEQ ID NO: 6直接連接；

（3）微藻異養發酵：當步驟（2）得到的糖液中葡萄糖濃度達到25-180 g/L后，使糖液通過發酵罐出口裝配的過濾組件進入生物反應器；向生物反應器中添加培養基組分，獲得發酵培養基，并高溫高壓滅菌；然后接入活化的微藻種子液，在16-34℃的溫度條件下發酵3-5天，至葡萄糖濃度不高于5g/L時發酵結束；或者在發酵過程中連續流加步驟（2）獲得的糖液，使糖濃度維持在5-10 g/L，在16-34℃的溫度條件、補氮且6.0-9.0的pH條件下發酵5-10天，獲得微藻發酵液；

（4）后處理：將步驟（3）得到的微藻發酵液離心處理，分離藻細胞與發酵后的培養基。

2.根據權利要求1所述的采用木質纖維素培養微藻的方法，其特征在于：還包括步驟（5），具體為：將步驟（4）固液分離得到的發酵后培養基不稀釋或經過1-3倍稀釋，用于配制步驟（2）的糖化培養基；所述微藻為具備異養生長能力的單細胞光合微生物，包括微擬球藻、柵藻、小球藻、寇氏隱甲藻、螺旋藻、雨生紅球藻；所述微擬球藻、小球藻、螺旋藻和雨生紅球藻可采用光周期的方式進行發酵培養。

3.根據權利要求2所述的采用木質纖維素培養微藻的方法，其特征在于：步驟（2）所述的糖化培養基為：磷酸氫二鉀2.9 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、尿素0.8 g/L、氯化鈣0.1 g/L、氯化鎂1.8 g/L、硫酸亞鐵0.0005 g/L、硫化鈉2 g/L、玉米漿4 g/L、檸檬酸三鈉2 g/L、pH6.5-7.5；步驟（3）所述的發酵培養基按照質量百分比由以下組分組成：酵母粉0.3%，玉米漿0.6%，磷酸二氫鉀0.3%，七水合硫酸鎂0.03%，硝酸鈉0.3%，其余為水，pH 6.0。

4.根據權利要求2所述的采用木質纖維素培養微藻的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的木質纖維素原料為玉米秸稈、麥秸、灌木條枝、木片、玉米芯、稻草和廢紙中的一種或多種的組合；所述預處理為堿法、稀酸法、水熱法、汽爆法和磺化法預處理技術中的一種或多種的組合；預處理后的木質纖維素底物為木質素含量不高于11%，半纖維素含量不高于12%；步驟（2）糖化步驟中的溫度條件為55-60℃，水解體系中的固液重量體積比為1:3-1:10。

5.根據權利要求2所述的采用木質纖維素培養微藻的方法，其特征在于：步驟（3）中，當葡萄糖濃度為60-150g/L后，使糖液通過發酵罐出口裝配的過濾組件進入生物反應器；在16-30℃的溫度條件下發酵3-5天，至葡萄糖濃度不高于5g/L時發酵結束，或者在發酵過程中連續流加步驟（2）獲得的糖液，使糖濃度維持在5-10 g/L，在16-30℃的溫度條件、補氮且6.0-6.5的pH條件下發酵5-10天；所述補氮操作具體為：流加50%（w/v）的玉米漿溶液進行補氮。