[發明專利]一株分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

在審

• 申請號: 201810934334.4
• 申請日: 2018-08-16
• 公開（公告）號: CN109022366A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 胥傳來;王忠興;匡華;徐麗廣;劉麗強;馬偉;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學;無錫迪騰敏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一株分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株20170506及其應用，屬于食品安全免疫檢測技術領域。本發明所述分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株20170506，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.14702，保藏日期為2017年9月5日；所述菌株可以分泌產生抗左旋咪唑單克隆抗體。該單抗對左旋咪唑具有較好親和力和較高靈敏度，對左旋咪唑的50%抑制濃度IC₅₀為17.2μg/L，可用于制備左旋咪唑的免疫檢測試劑盒以及膠體金試紙條，為動物源性食品中左旋咪唑的檢測提供有力的檢測方法及手段。

技術領域

本發明涉及一株分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測技術領域。

背景技術

左旋咪唑是一種人工合成的廣譜驅腸蟲藥，應用歷史悠久，主要用于驅蛔蟲和鉤蟲，曾經被世界衛生組織和我國衛生部等有關部門認定或推薦為治療蛔蟲病和鉤蟲病的藥物。對多種動物的胃腸道線蟲和肺線蟲成蟲及幼蟲均有高效，在獸醫臨床上用于治療蛔蟲、鉤蟲、蟯蟲、糞圓線蟲和絲蟲等感染。隨著左旋咪唑應用范圍的不斷擴大，不良反應的報道不斷增多，主要表現有消化系統毒副作用、神經系統毒副作用、心血管系統毒副作用、泌尿系統毒副作用等。因此，建立有效的左旋咪唑殘留檢測方法，對有效控制畜產品中左旋咪唑的殘留，促進畜牧養殖業的健康發展，保障廣大人民群眾的身體健康，具有深遠的意義。

目前左旋咪唑檢測多采用儀器檢測方法，如高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等。儀器檢測方法可進行定量分析并具有較低的檢測限，但是通常需要昂貴的儀器和復雜的操作，前處理及檢測時間長，嚴重制約了這些檢測方法的推廣。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對技術人員相對要求低等特點，因此適用于大量樣品的快速篩查。

發明內容

本發明的目的在于克服上述不足之處，提供一株分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，由該細胞株制備的單克隆抗體對左旋咪唑具有較好的親和力和靈敏度，可以用來建立左旋咪唑酶聯免疫檢測方法，或建立膠體金免疫層析試紙條快速檢測方法。

按照本發明提供的技術方案，一株分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株20170506，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.14702，保藏日期為2017年9月5日。

抗左旋咪唑單克隆抗體，其由所述保藏編號為CGMCC No.14702，分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株20170506分泌產生。

所述抗左旋咪唑單克隆抗體的應用，將其應用在食品安全中左旋咪唑殘留的檢測中。

本發明提供的分泌抗左旋咪唑單克隆抗體的雜交瘤細胞株20170506的制備步驟為：

（1）免疫原的制備與鑒定：以氨基左旋咪唑為原料，通過戊二醛法與蛋白載體的氨基相連，反應結束后，通過透析分離完全抗原和未偶聯的小分子半抗原，完全抗原通過紫外吸收掃描方法鑒定；

（2）小鼠的免疫：選取6～8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。將免疫原與福氏佐劑乳化完全后，通過皮下多點注射免疫小鼠，首次免疫采用福氏完全佐劑，加強免疫使用福氏不完全佐劑，沖刺免疫時免疫劑量為前一次免疫劑量的一半，與生理鹽水混合均勻后直接進行腹腔注射；各次免疫間隔為三周。第三次免疫后，間隔一周采血檢測血清效價和抑制；

（3）細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（PEG 2000）法，使小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養基培養，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株20170506；

（4）雜交瘤細胞株20170506性質的鑒定：采用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標二抗套裝測定；IC₅₀值、交叉反應率和親和力的測定通過ELISA法。