[發(fā)明專利]葡萄糖刺激的胰島素分泌測定模型

在審

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• 申請日: 2018-08-16
• 公開（公告）號: CN109030804A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張從曉;王克威;劉慧芳
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 北京匯捷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

本發(fā)明公開了葡萄糖刺激的胰島素分泌測定模型。確定24h為胰島β細(xì)胞的培養(yǎng)給藥時(shí)間；利用ELISA方法測定胰島素濃度；通過CCK8法測定OD值來間接反映細(xì)胞數(shù)量；選擇HBSS溶液作為以后的細(xì)胞外緩沖液進(jìn)行使用；選擇促胰島素分泌陽性藥格列本脲對胰島β細(xì)胞胰島素的分泌促進(jìn)。本發(fā)明建立的模型能夠反映高糖和基礎(chǔ)糖不同刺激的差異，能夠反映陽性藥格列本脲在高通和基礎(chǔ)糖條件下的刺激胰島素分泌的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及葡萄糖刺激的胰島素分泌測定模型。

背景技術(shù)

2型糖尿病是糖尿病的主要類型，占90％～95％，是一種胰島素抵抗伴胰島素不足、胰島素分泌缺陷伴有或不伴有胰島素抵抗而導(dǎo)致的慢性高血糖疾病。2型糖尿病的發(fā)生與胰島β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素、血液循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)送胰島素及靶細(xì)胞接受胰島素并發(fā)揮生理作用等密切相關(guān)，這三個(gè)過程是研發(fā)2型糖尿病的依據(jù)，其中促胰島素分泌類藥物是抗2型糖尿病藥物研發(fā)的重要類型。促胰島素分泌藥物主要是以磺酰脲受體為靶點(diǎn)的磺酰脲類和格列奈類藥物，但存在療效有限、易產(chǎn)生毒副作用等問題。因此，研發(fā)療效好、毒副作用小的新型促胰島素分泌類抗糖尿病藥物是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。促進(jìn)胰島素分泌藥的主要作用機(jī)制是促進(jìn)胰島β細(xì)胞釋放胰島素,并且增加胰島β細(xì)胞對血糖刺激的敏感性。臨床已經(jīng)應(yīng)用的促胰島素分泌劑主要分為磺酰脲藥物和非磺酰脲藥物，這兩類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)存在較大差異,但具有相似的促胰島素分泌作用機(jī)理。

藥物篩選是藥物研發(fā)開始的必要步驟，通過對生物效應(yīng)分子的檢測，發(fā)現(xiàn)具有生物活性的天然產(chǎn)物和人工合成化合物。隨著科學(xué)技術(shù)不斷的發(fā)展，藥物篩選技術(shù)也產(chǎn)生巨大的進(jìn)步，逐漸從動(dòng)物模型發(fā)展到細(xì)胞、分子水平，，良好的胰島素分泌模型對于提高抗糖尿病藥物研發(fā)速度、保證藥物篩選質(zhì)量、降低藥物研發(fā)成本具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供葡萄糖刺激的胰島素分泌測定模型。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是按照以下條件進(jìn)行：

條件1.確定24h為胰島β細(xì)胞的培養(yǎng)給藥時(shí)間；

條件2.利用ELISA方法測定胰島素濃度；

條件3.通過CCK8法測定OD值來間接反映細(xì)胞數(shù)量；

條件4.選擇HBSS溶液作為以后的細(xì)胞外緩沖液進(jìn)行使用；

條件5.選擇促胰島素分泌陽性藥格列本脲對胰島β細(xì)胞胰島素的分泌促進(jìn)。

進(jìn)一步，步驟2中，選定抗糖尿病相關(guān)試劑專業(yè)公司瑞典Mercodia生產(chǎn)的大鼠胰島素測定試劑盒進(jìn)行胰島素測定。

進(jìn)一步，步驟3中，選定0.5h作為細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞與CCK8孵育的時(shí)間。

本發(fā)明研究利用多孔板技術(shù)和ELISA夾心法相結(jié)合，通過探索優(yōu)化多孔板胰島β細(xì)胞接種數(shù)量、細(xì)胞培養(yǎng)條件、細(xì)胞計(jì)數(shù)方法、外緩沖液配方，以及ELISA試劑種類、測定條件、稀釋倍數(shù)等，最終建立葡萄糖刺激的胰島β細(xì)胞胰島素分泌(GSIS)模型。結(jié)果表明，建立的GSIS模型能夠反映高糖和基礎(chǔ)糖不同刺激的差異，能夠反映陽性藥格列本脲在高通和基礎(chǔ)糖條件下的刺激胰島素分泌的作用

附圖說明

圖1是不同密度的細(xì)胞接種到96孔板上24h后10倍物鏡下拍攝的顯微照片；

圖2是不同密度的在54h內(nèi)每隔8h測定的細(xì)胞生長曲線；

圖3是胰島素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4是樣品稀釋倍數(shù)的優(yōu)化；

圖5是孵育時(shí)間的優(yōu)化；

圖6是胰島β細(xì)胞葡萄糖刺激或HACAT細(xì)胞、TM細(xì)胞培養(yǎng)液胰島素含量；

圖7是不同細(xì)胞外緩沖液條件下胰島β細(xì)胞胰島素的分泌；