[發(fā)明專利]一種經(jīng)熱穩(wěn)定性改造的角蛋白酶突變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810933226.5
• 申請(qǐng)日: 2018-08-16
• 公開（公告）號(hào): CN108949729B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔勁松;陶麗妍;蘇暢;許正宏;史勁松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/50
• 分類號(hào): C12N9/50;C12N15/57;C12N15/70;C12N15/74;C12N15/81;C12N15/80;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;C12P21/06
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林;馮瑞

本發(fā)明公開了一種經(jīng)熱穩(wěn)定性改造的角蛋白酶突變體，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于角蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模型，針對(duì)角蛋白酶的酶蛋白Loop區(qū)域上的8個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)，采用一步反向PCR構(gòu)建熱穩(wěn)定性突變重組菌，熱穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示突變體N218S角蛋白酶在60℃的熱穩(wěn)定性提高了3倍以上。利用角蛋白酶進(jìn)行降解羽毛研究。觀察到角蛋白酶處理48h后的羽毛表面呈現(xiàn)開叉、毛糙狀，羽毛降解率達(dá)到25％，羽毛降解液中氨基酸總含量增加了1.82mg/mL。該研究為降解羽毛制備高質(zhì)量飼料以及降解硬質(zhì)角蛋白廢棄物奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種經(jīng)熱穩(wěn)定性改造的角蛋白酶突變體，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

角蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜、剛性強(qiáng)，含有豐富的二硫鍵，因此難以被普通蛋白酶降解。角蛋白酶是能夠特異性降解羽毛、羊毛、毛發(fā)、指甲等富含角蛋白的特殊的蛋白酶類。其首先通過二硫鍵還原作用打開角蛋白中復(fù)雜的二硫鍵，進(jìn)而通過蛋白水解作用實(shí)現(xiàn)角蛋白的降解。角蛋白酶的特殊性使其能夠廣泛地運(yùn)用于畜牧行業(yè)、飼料行業(yè)、制革行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)中。

總結(jié)已有研究來看，角蛋白酶的酶活及熱穩(wěn)定性普遍較差。其中熱穩(wěn)定性不足的問題使得在實(shí)際應(yīng)用中通常需要通過加熱來加速反應(yīng)，提高了能耗，且角蛋白酶粉制備時(shí)的噴霧干燥過程也需要加熱，因此，熱穩(wěn)定的角蛋白酶在實(shí)際應(yīng)用中非常重要。提高酶熱穩(wěn)定性的方法包括添加保護(hù)劑、酶的化學(xué)修飾、固定化以及蛋白質(zhì)工程改造等。基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)突變改造是改變酶熱穩(wěn)定性的有效方法，近年來，建立在分子信息學(xué)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，基于蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)或同源模型，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)能對(duì)角蛋白酶進(jìn)行半理性或理性的蛋白質(zhì)工程改造，為提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性提供可行的技術(shù)手段。美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中存在角蛋白酶保守位點(diǎn)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等信息，通過對(duì)信息的初步檢索、分析以及進(jìn)行計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，確定熱穩(wěn)定性改造的潛在位點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建突變體，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，考察重組酶的表達(dá)情況及其熱穩(wěn)定性。

隨著綠色產(chǎn)業(yè)的推動(dòng)，迫切需要角蛋白酶產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)，但目前角蛋白酶的穩(wěn)定性總體仍未達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用的需求。早期研究中本課題組也對(duì)角蛋白酶(Bpker)進(jìn)行了熱穩(wěn)定性改造，但親本的酶活明顯偏低，發(fā)酵最高酶活僅為70U/mL(CN107828765A)。課題組前期已構(gòu)建獲得一株具有高角蛋白水解酶活的角蛋白酶KerBv重組菌，在5L發(fā)酵罐上角蛋白酶活力高達(dá)7000U/mL以上，是目前文獻(xiàn)已報(bào)道的重組角蛋白酶表達(dá)的最高水平。但是該菌株的熱穩(wěn)定性還不適用于工業(yè)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明在構(gòu)建角蛋白酶KerBv三維結(jié)構(gòu)模型的基礎(chǔ)上，采用定點(diǎn)突變改造策略提升角蛋白酶的熱穩(wěn)定性，重點(diǎn)對(duì)熱穩(wěn)定性影響關(guān)鍵的Loop區(qū)域中的位點(diǎn)進(jìn)行突變改造，提高該高酶活重組菌所產(chǎn)角蛋白酶的穩(wěn)定性，將能夠更好地服務(wù)于應(yīng)用，具有更大的市場(chǎng)價(jià)值及應(yīng)用潛力。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種角蛋白酶突變體，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶為親本，將親本角蛋白酶的第118位天冬酰胺、第218位天冬酰胺、第236位絲氨酸中至少一處突變?yōu)槠渌陌被帷?/p>

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將親本角蛋白酶的第118位天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將親本角蛋白酶的第218位天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將親本角蛋白酶的第236位絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述的角蛋白酶突變體的基因。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種攜帶所述基因的載體。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述角蛋白酶突變體的重組菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組菌以芽孢桿菌、大腸桿菌、酵母、絲狀真菌中的任意一種為宿主菌。