[發(fā)明專利]一種離體培養(yǎng)提高甜葉菊甜菊雙糖苷SBIO含量的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810930168.0
• 申請(qǐng)日: 2018-08-15
• 公開（公告）號(hào): CN108935103A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張永;李存彪;張磊;鄭成淑
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽蚌埠惠農(nóng)甜葉菊高科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京匯信合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 孫民興

本發(fā)明公開了一種離體培養(yǎng)提高甜葉菊甜菊雙糖苷SBIO含量的方法，屬于細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，主要包括以下步驟：(1)以甜葉菊葉片為離體培養(yǎng)的外植體材料，將其接種到愈傷組織培養(yǎng)基；(2)產(chǎn)生綠色愈傷組織后，轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(3)產(chǎn)生幼芽后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量根系后，按常規(guī)繼代培養(yǎng)和擴(kuò)繁，獲得甜菊雙糖苷SBIO含量高的株系。不同培養(yǎng)基中均加入半乳糖苷酶作為甜菊苷轉(zhuǎn)化為甜菊雙糖苷的水解酶，利用本發(fā)明提供的離體培養(yǎng)提高甜葉菊甜菊雙糖苷SBIO含量的方法，經(jīng)過培養(yǎng)后甜葉菊甜菊雙糖苷SBIO含量顯著增加，培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單、高效。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和生物領(lǐng)域，為一種離體培養(yǎng)提高甜葉菊甜菊雙糖苷SBIO含量的方法，具體涉及通過甜葉菊離體培養(yǎng)來提高甜葉菊葉片中甜菊雙糖苷SBIO含量的方法。

背景技術(shù)

甜菊糖苷(steviol glycoside，SGs)是一類從甜葉菊(Stevia rebaudianaBertoni)葉子中提取得到的高甜度、低熱值甜味劑，甜葉菊被譽(yù)為繼甘蔗和甜菜之后的“第三糖源”。甜菊糖苷還具有藥理活性，如降三高、抗腫瘤、抑菌、增溶、抗腹瀉等特性，亦可作為合成其他功能性化合物的前體物質(zhì)。甜菊糖苷的化學(xué)本質(zhì)為四環(huán)二萜。甜菊糖國家標(biāo)準(zhǔn)(GB8270－2014)中列出含量最高的九種甜味成分，即甜菊苷(stevioside，Stv)，瑞鮑迪苷A-E(rebaudioside A、B、C、D和E)，杜克苷A(dulcoside A)，甜茶苷(rubusoside)和甜菊雙糖苷(steviolbioside，sbio)。甜菊雙糖苷分子式為C₃₂H₅₀O₁₃，分子量為642.73。

甜菊雙糖苷與甜菊苷(ST)相比，其分子式中的19碳位上少一個(gè)葡糖基。甜菊雙糖苷具有降血糖，抗結(jié)核等功效，也可以作為中間體進(jìn)一步衍生成為其他生理活性更好的化合物，如甜菊雙糖苷酯、甜菊雙糖苷酰肼等對(duì)抗菌和抗結(jié)核具有療效的化合物。但是，甜菊雙糖苷在甜葉菊中的含量很低，而甜菊苷相對(duì)含量較高。已有研究報(bào)道，甜菊雙糖苷可以通過甜菊苷的水解酶法，即β-半乳糖苷酶水解法獲得。

已有研究表明，β-半乳糖苷酶可以選擇性水解甜菊苷中碳19位糖酯鍵，從而獲得甜菊雙糖苷，而且在37.5℃，甜菊苷的底物濃度為25mg/mL，加入β-半乳糖苷酶量為12000U/g ST，12h時(shí)甜菊苷的轉(zhuǎn)化率為99％以上。但這個(gè)方法，只能解決甜菊雙糖苷提取的工藝問題，并不能長(zhǎng)期解決甜葉菊中提高甜菊雙糖苷含量的瓶頸問題。因此，我們考慮到采取離體培養(yǎng)基中加入水解酶的方法，或許能夠間接地獲得高甜菊雙糖苷含量的甜葉菊植株。另外，考慮到甜葉菊從葉片脫分化形成大量愈傷組織的過程中細(xì)胞內(nèi)的甜菊苷，通過吸收培養(yǎng)基中的水解酶，β-半乳糖苷酶，將愈傷組織細(xì)胞中的甜菊苷水解為甜菊雙糖苷，并在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存，或重新分配在細(xì)胞組織中。但迄今為止，通過離體組織培養(yǎng)提高甜葉菊葉片甜菊雙糖苷含量的研究未見報(bào)道。因此，我們嘗試通過組織培養(yǎng)的方法，向各階段培養(yǎng)基中添加外源β-半乳糖苷酶，希望獲得葉片中甜菊雙糖苷含量較高的甜葉菊株系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種離體培養(yǎng)提高甜葉菊甜菊雙糖苷SBIO的方法，屬于細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，其能夠快速獲得甜菊雙糖苷SBIO含量高的甜葉菊組培苗，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。

本發(fā)明提供一種離體培養(yǎng)提高甜葉菊甜菊雙糖苷SBIO含量的方法，其主要過程如下：

(1)以甜葉菊葉片為外植體接種到愈傷組織培養(yǎng)基；其培養(yǎng)基組成為：MS+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+600U/gβ-半乳糖苷酶；其組培室環(huán)境溫度15-35℃(優(yōu)選為25±1℃)，光強(qiáng)1500-3000Lux(優(yōu)選為2000Lux)，光周期晝7-17h/夜7-17h(優(yōu)選為光周期晝12h/夜12h)。