[發(fā)明專利]一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810928216.2 | 申請日： | 2018-08-15 |
| 公開（公告）號： | CN109142496A | 公開（公告）日： | 2019-01-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 柳意樊;劉炳艦;張建設(shè);景斐;夏立萍 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江海洋大學(xué) |
| 主分類號： | G01N27/447 | 分類號： | G01N27/447;G01N21/64;G01N1/30 |
| 代理公司： | 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213 | 代理人： | 吳秉中 |
| 地址： | 316000 浙江省*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 曼氏無針烏賊 胚胎 檢測 性成熟 熒光顯微鏡 消化 受精卵 電泳 獨(dú)特優(yōu)點(diǎn) 發(fā)育時期 個體健康 著色效果 自然交配 蛋白酶K 漂洗 游動 裂解液 靈敏性 瓊脂糖 水楊酸 消化液 樣本量 染色 產(chǎn)卵 受精 放入 膠板 裂解 卵膜 測量 圖像 清晰 觀察 分析 | ||
1.一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法，包括不同發(fā)育時期胚胎收集和DNA損傷的檢測，其特征在于：所述DNA損傷的檢測：將胚胎用PBS漂洗兩次，剝?nèi)ヂ涯?，并在室溫下用含有蛋白酶K和水楊酸的消化液消化；消化完全后利用瓊脂糖制成膠板，然后放入裂解液中裂解，電泳，染色，在熒光顯微鏡下觀察，測量，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法，其特征在于：所述消化液中含8-12μg/ml蛋白酶K和1.0-1.5μg/ml水楊酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法，其特征在于：所述發(fā)育≤24h的胚胎消化處理時間為5-10min，發(fā)育＞24h的胚胎消化處理15-30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法，其特征在于：所述膠板制備的具體步驟為：第一層為濃度0.5-1.5%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖，凝固后加濃度為0.5-1.0%、含細(xì)胞懸液的低熔點(diǎn)瓊脂糖，細(xì)胞懸液和低熔點(diǎn)瓊脂糖的體積比為1:0.9-1.1，置于0-5℃黑暗條件下固定30-60min，即得膠板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法，其特征在于：所述裂解用裂解液含2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris base、3-4mM DMF、1.5-2.5mM二甲基甲酰胺、1%曲拉通X-100、10%二甲基亞砜的混合液，其pH值為10.0；所述裂解條件為：在0-5℃黑暗條件下15-20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法，其特征在于：所述電泳液為含0.3M NaOH和1mM EDTA的水溶液，其pH≥13.0；所述電泳的電壓為20-30V，電流為200-400mA，時間為10-30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法，其特征在于：所述受精卵收集：選取游動性強(qiáng)、個體健康的性成熟曼氏無針烏賊，其中雌雄比例為1:1.5-2.5，在25-28℃下混合飼養(yǎng)，避光隔夜后，次日早晨燈光刺激雌雄魚自然交配產(chǎn)卵，收集受精卵及不同發(fā)育時期胚胎，用PBS迅速清洗，在解剖鏡下挑選各個發(fā)育時期的胚胎。
8.一種曼氏無針烏賊胚胎DNA損傷的檢測方法的用途，檢測方法可用于胚胎質(zhì)量及水環(huán)境因子的評價。
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