[發明專利]一種基于PiggyBac載體的Her2-CAR-T系統構建方法

在審

• 申請號: 201810926458.8
• 申請日: 2018-08-15
• 公開（公告）號: CN109097392A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 馬曉冬;劉明;林展雯;李潯;黃行許
• 申請（專利權）人: 馬曉冬
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 廣州專理知識產權代理事務所(普通合伙) 44493
• 代理人: 譚昉

本發明涉及Her2?CAR?T系統構建技術，特別是涉及一種基于PiggyBac載體的Her2?CAR?T系統構建方法，其是通過設計合成Her2?CAR基因片段，然后將Her2?CAR基因片段連接到Piggybac載體上得到Piggybac?CAR?Her2，再將Piggybac?CAR?Her2轉入大腸桿菌中進行擴增，然后從大腸桿菌中提取質粒，并加入到人血清中分離的淋巴細胞中進行擴展培養，采用Nucleofector細胞轉染系統轉染共轉染質粒Piggybac?CAR?Her2和Piggybac Transposase到T淋巴細胞，得到帶有Her2?CAR基因片段的T淋巴細胞。本發明采用非病毒類載體PiggyBac系統，避免了使用病毒載體存在的安全隱患，具有更高的安全性和有效性，更加適用于臨床治療；采用的Nucleofector細胞核技術，能夠將外源基因直接導入到細胞核，克服了脂質體轉染和普通電穿孔，必須依賴細胞分裂時才有可能使外源基因入核表達的缺陷，細胞具有更高的存活率和增殖效率。

技術領域

本發明涉及Her2-CAR-T系統構建技術，特別是涉及一種基于PiggyBac載體的Her2-CAR-T系統構建方法。

背景技術

CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細胞免疫療法）是近年來發展起來的新的過繼免疫細胞治療手段，通過基因工程手段修飾T細胞，使其表達嵌合抗原受體，嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相關抗原靶點，識別結合后將激活增殖T細胞的信號傳遞至胞內，引起T細胞激活和增殖，從而有效殺傷腫瘤細胞。CAR分子大致可分為5代演變：I代，特異性T細胞激活；II代，增加共刺激因子，提高細胞毒性；III代，同時具有兩個共刺激因子，提高T細胞增殖能力與殺傷毒性；IV代，整合自殺基因，精確調控，細胞因子釋放（如IL-7和IL-15）激活等；V代，通用型CAR。相比于在體外擴增效率低，細胞毒活性不理想的NK細胞、沒有特異性殺瘤作用的CIK細胞以及在外周血中不易獲取且制備困難的DC細胞治療，CAR-T技術具有許多獨特的優勢，如CAR能非MHC依賴性識別腫瘤抗原，不需要經過APC。腫瘤表面蛋白類和脂類抗原都可以作為靶點，具有廣泛的抗原譜；有共刺激分子，能有效增強T細胞增殖。因此該技術被認為是有望徹底攻克人類癌癥的獨特方法。

人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,Her2)基因，即ERBB2基因，是具有絡氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，參與發育中的胚胎和成人組織細胞的生長、分化與增殖。研究發現Her2基因產物過度表達與腫瘤的發生發展以及腫瘤的侵襲性正相關。研究顯示Her2在乳腺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、食道癌等多種癌癥中發生過度表達。目前，CAR-T免疫治療已在許多臨床實驗上取得巨大進展。其中，針對人類表皮生長因子受體2（Her2）陽性的晚期、不可切除、轉移性或復發性的實體瘤，如膽管癌（biliary tract cancer,BTC）、胰腺癌（pancreatic cancer,PC），小兒腦膠質瘤（pediatric glioblastoma）和成人腦膠質瘤（adult glioblastoma），CAR-T-Her2 T細胞免疫治療療效顯著，安全耐受而且沒有明顯的劑量限制性毒性。已有報告顯示CAR-T-Her2在治療晚期復發性和難治性的膽管癌和胰腺癌中可以實現約55%的疾病控制率（DiseaseControl Rate，DCR），包括完全緩解、部分緩解和疾病穩定的病例；在治療19例復發性的肉瘤（骨肉瘤，尤文肉瘤，原發性神經外胚層腫瘤，增生性小圓細胞腫瘤）中除了實現42%疾病控制率，其中3例患者得到完全緩解（Complete remission ，CR),有1例腫瘤壞死灶高達90%，4例患者維持12周至14個月的疾病穩定（Stable Disease，SD），其中3例在摘除遠端轉移的腫瘤后仍在之后的6、12和16個月得到緩解。有些患者經CAR-T治療后還獲得了持久性緩解，在注射CAR-T細胞后可在體內維持低濃度水平長達一年。