[發(fā)明專利]一種原代干細(xì)胞分離液以及分離原代間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810921295.4
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號(hào): CN109370984A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛宜青;顏學(xué)恒
• 申請（專利權(quán)）人: 上海逍鵬生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 上海遠(yuǎn)同律師事務(wù)所 31307
• 代理人: 張堅(jiān)

本發(fā)明涉及一種原代干細(xì)胞分離液以及采用該原代干細(xì)胞分離液從臍帶中分離原代間充質(zhì)干細(xì)胞的方法；本發(fā)明的原代干細(xì)胞分離液采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為溶液以及添加特定濃度的膠原酶I型、分散酶II型和脫氧核糖核酸酶的組合，能夠快速便捷地從臍帶組織中收獲大量且健康的原代間充質(zhì)干細(xì)胞，大大提高了間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的可控性和細(xì)胞收獲率，不論是對于科研實(shí)驗(yàn)的條件控制或是臨床應(yīng)用的安全性都具有很大的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種原代干細(xì)胞分離液及其制備方法，以及從臍帶組織中分離原代間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs，mesenchymal stem cells)，最早在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，是一種來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有自我更新能力、多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控、可連續(xù)培養(yǎng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已受到越來越多的關(guān)注。

間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外一定條件下可以向多種細(xì)胞組織類型分化。它不僅可以向多種間質(zhì)來源的細(xì)胞譜系分化，也可以向其他的細(xì)胞譜系分化。由于體外分離培養(yǎng)的MSCs在細(xì)胞表型上沒有明顯的改變，也無功能缺失，因此被認(rèn)為是理想的修復(fù)和抗衰老細(xì)胞來源。

目前已知間充質(zhì)干細(xì)胞可從骨髓、脂肪組織、華頓氏膠質(zhì)、臍帶、軟骨組織和齒齦分離出來，其中自臍帶可以獲得更多的干細(xì)胞，且臍帶取得容易，無需侵入性的醫(yī)療程序。并且，自臍帶分離的干細(xì)胞，表面所攜抗原少且具有抑制免疫反應(yīng)的特性，對于克服異體排斥反應(yīng)，有更顯著的效果，因此極具推廣應(yīng)用的價(jià)值。

常見的原代細(xì)胞分離方式是組織塊法，這個(gè)分法雖然簡單，但人工操作的時(shí)間很長，之后原代細(xì)胞生長也不平均，因此也有人使用酶消化法。可是該如何選擇消化酶的組合，以什么樣的劑量操作、又以什么樣的條件反應(yīng)才能取得比組織塊法更多的細(xì)胞量，本領(lǐng)域一直沒有清楚地了解過。

因此，本領(lǐng)域希望能夠開發(fā)出適合原代干細(xì)胞分離的分離液，特別是從臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的分離液。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于相關(guān)技術(shù)的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明一方面提供了一種原代干細(xì)胞分離液，其中，

所述原代干細(xì)胞分離液為含有添加組分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基；

所述添加組分及其濃度如下：

膠原酶I型225-250U/ml；

分散酶II型0.4～0.6U/ml；

脫氧核糖核酸酶5-10U/ml；

所述膠原酶I型和所述分散酶II型均是以細(xì)菌為載體的重組表達(dá)產(chǎn)品；所述脫氧核糖核酸酶是以酵母菌為載體的重組表達(dá)產(chǎn)品。

優(yōu)選的，所述添加組分及其濃度如下：

膠原酶I型240U/ml；

分散酶II型0.5U/ml；

脫氧核糖核酸酶8U/ml。

本發(fā)明另一方面提供了一種從臍帶組織分離原代間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其中，

該方法包括以下步驟：

步驟1)，將獲得的臍帶組織剪成2-5mm³的大小的臍帶組織塊；

步驟2)，將所述臍帶組織塊浸潤到權(quán)利要求1或2所述的原代干細(xì)胞分離液中，在37攝氏度的溫度環(huán)境下反應(yīng)至少10小時(shí)；

步驟3)，待步驟2)反應(yīng)完成，向其中加入0.05％EDTA溶液終止反應(yīng)，所述EDTA溶液的體積與所述原代干細(xì)胞分離液的體積相同；