[發明專利]家蠶核型多角體病毒誘導型39K啟動子及其重組載體和應用

有效

• 申請號: 201810917308.0
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108998455B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 潘敏慧;董戰旗;魯成;陳鵬;曹明亞;李海清;蔣亞明;胡志剛
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/866;A01K67/033
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發明涉及家蠶核型多角體病毒誘導型39K啟動子及其重組載體和應用，該啟動子是以BmNPV延遲早期基因39K的啟動子最優序列作為“母體”啟動子，逐步截短分析降低啟動子長度，構建重組啟動子，仍具有很強的BmNPV誘導啟動活性，并驗證家蠶核型多角體病毒立即早期基因IE?1蛋白可以轉錄結合39K(?310～?355)區域誘導39K啟動子表達，我們利用該區域構建了不同的人工合成誘導型啟動子，能夠高效提高39K及其他不同啟動子誘導表達活性，該人工合成誘導型啟動子不但適用于基因功能分析等分子生物學理論研究和家蠶核型多角體病毒表達系統應用研究，同時適用于利用基因工程技術進行的家蠶品種改良。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及家蠶核型多角體病毒誘導型39k啟動子，還涉及含有該啟動子的重組載體和應用。

背景技術

家蠶是具有重要經濟價值的鱗翅目模式昆蟲。蠶絲業為世界經濟、文化和社會發展做出了重要貢獻。家蠶和家蠶核型多角體病毒作為高效表達外源蛋白的生物反應器，在生物工程領域具有重要的應用價值。天然啟動子的低表達活性和非特異性在生物工程的應用中存在一定的局限性。在前期研究工作中，發明人所在課題組發明了BmNPV 39K誘導型啟動子(ZL201010231957.9)以及改造后的增強型En39K(ZL201310641709.5)。該啟動子具有BmNPV誘導啟動活性，能使細胞在受到BmNPV感染時啟動外源基因的表達，但其啟動子長度太長，核心調控區域未知，已不能滿足現實需要。迫切需要在家蠶(鱗翅目)中構建高效的人工合成誘導型啟動子滿足不同生物工程需求。

誘導型啟動子是誘導型調控序列或誘導型增強子，是一組能在特定物理、化學或病原體信號刺激下增強外源基因表達的啟動子。一般而言，誘導型啟動子與轉錄激活子一樣，以非活性形式存在，并可通過相應的信號刺激直接或間接激活。目前，誘導型啟動子(Cre/LoxP、Tet-ON/Tet-OFF、蛻皮激素和病原體誘導系統)的幾種技術方法被廣泛應用于動植物基因工程領域，包括基因功能鑒定或品種改良。昆蟲是地球上最大的生物類群。很多經濟昆蟲(如蠶和蜜蜂)具有非常重要的經濟價值。然而，在昆蟲基因工程研究中還沒有一個較好的誘導系統，因此在抗病育種和基因治療中構建致病誘導型啟動子具有重要意義。

人工合成的啟動子是通過結合不同啟動子元件的不同組合來構建更強的表達水平，并用啟動子的不同組合替換或重新設計序列。植物中的合成啟動子的研究相對較多，大多集中在合成誘導型合成啟動子上。合成啟動子主要是利用順式調控元件來融合核心啟動子。構建不同病原誘導型人工啟動子可有效提高轉基因抗病基因在植物抗病育種中的廣譜性。或者，構建與組織特異性啟動子(根、莖、葉等)和誘導型啟動子結合的人工誘導啟動子有助于特定組織誘導表達，以提高作物品質和提高作物抗性和抗病性。人工合成的啟動子也被報道在動物，其構建方法主要是通過不同表達調控序列的同向組裝，應用于靶向治療疾病，以及外源基因的特異性組織表達。人工合成啟動子在昆蟲研究中才剛剛起步，特別是在昆蟲疾病育種領域。

在以前的研究中，篩選了BmNPV誘導啟動子(VP1054、P33、BM21、BM122、39K、p143和p6.9)活性，發現39K啟動子具有最高的BmNPV誘導的轉錄活性(ZL201010231957.9)。并使用HR3、H5、POLH和PU的增強子進一步增強BmNPV 39K啟動子的病毒誘導活性。可誘導的39K啟動子控制的外源Hycu-ep32基因的過度表達在轉基因品系中具有高的抗病毒能力。此外，我們構建了一個家蠶核型多角體病毒誘導的RNA干擾系統，它可以抑制BMNPV復制，受到病毒感染的嚴格控制，并且對宿主細胞沒有毒性。并且高效的利用病毒誘導的39K啟動子CRISPR/Cas9基因編輯系統，降低了潛在的靶效和高的編輯效率，增強了家蠶細胞的抗病毒能力。因此，為了使病毒誘導的39K啟動子在基因功能研究、家蠶抗性育種和害蟲防治中更有效，人工合成誘導型啟動子在昆蟲中是非常迫切的。

發明內容