[發(fā)明專利]一種數(shù)字PCR系統(tǒng)及數(shù)字PCR液滴形成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810916861.2
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN110819702B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳炫燁;關(guān)一民
• 申請（專利權(quán)）人: 上海新微技術(shù)研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 劉星

本發(fā)明提供一種數(shù)字PCR系統(tǒng)及數(shù)字PCR液滴形成方法，該數(shù)字PCR系統(tǒng)包括液滴形成組件及液滴噴孔組件，所述液滴形成組件包括導(dǎo)熱板及蓋板，所述蓋板的一側(cè)面設(shè)有至少一個倒U型臺階，所述導(dǎo)熱板、所述蓋板及所述倒U型臺階共同圍成底部開口的液滴形成腔室；所述液滴噴孔組件連接于所述液滴形成組件下方，包括若干液滴噴孔，所述液滴噴孔與所述液滴形成腔室連通，且所述液滴噴孔內(nèi)設(shè)有汽化部件，用于使所述液滴噴孔中的數(shù)字PCR溶液液體層汽化并快速推入所述液滴形成腔室中的液滴形成油中，以形成數(shù)字PCR液滴。本發(fā)明使用熱泡技術(shù)進行高速數(shù)字PCR液滴形成，具有高效的數(shù)字PCR油利用率，并可進行原位PCR溫控及原位數(shù)字PCR信號收集。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是疾病檢測領(lǐng)域，涉及一種一體化原位數(shù)字PCR系統(tǒng)及 液滴形成方法。

背景技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)提出至今已有20年時間，期間PCR已 發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā) 展。特別是90年代后期，美國ABI公司推出的實時熒光定量PCR(real timePCR，qPCR)技術(shù) 及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性 和精確定量的基因分析技術(shù)。

盡管經(jīng)過十幾年時間的迅速發(fā)展，qPCR技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的 診斷，但是，在PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素有很多，不能保證在反應(yīng)過程中擴增 效率保持不變和實際樣品與標準樣品以及不同樣品之間的擴增效率是相同的，由此導(dǎo)至其定 量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。因此qPCR的定量只是“相對定量”， 其準確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。

20世紀末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)的概念，通過將一個樣本分 成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA 模板)，在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒 光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析。與qPCR不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴增效率影響，擴增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能 夠?qū)⒄`差控制在5％以內(nèi)，數(shù)字PCR可以不需要對照標準樣品和標準曲線來實現(xiàn)絕對定量分 析。

數(shù)字PCR(也可稱單分子PCR)一般包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴增和熒光信號分析。在PCR 擴增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，數(shù)字PCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾 十至幾萬個單元中進行反應(yīng)。不同于qPCR對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，數(shù)字PCR 技術(shù)是在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集。最后通過直接計數(shù)或泊松分布公 式計算得到樣品的原始濃度或含量。

由于數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，相較于qPCR，能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量，因此特別適用于依靠CT值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域，例如拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

目前市面上的數(shù)字PCR技術(shù)主要有三種。一種是通過在特定儀器中使用流動的油切斷水 相的PCR溶液形成液滴，然后在另外的兩臺儀器中完成PCR和檢測；一種是通過將PCR溶 液分布到挖空的硅片上，然后在特定儀器中進行PCR以及另外一臺儀器中進行檢測；最后一 種是在一種儀器上將液體通過狹窄的溝道注入腔體形成液滴，并完成PCR，然后在另一臺儀 器中完成檢測。然而，當前的三種方法的液滴形成速度或者通量各有限制。此外，上述三種 技術(shù)無一例外的依賴多臺大型儀器。這不但增加了儀器的購置的成本，限制了數(shù)字PCR的廣 泛使用；而且增加了實驗操作的復(fù)雜度。

因此，如何提供一種大于每秒形成1000個液滴的高速的數(shù)字PCR液滴形成技術(shù)、液滴 形成與PCR溫控和檢測儀器集成的原位PCR技術(shù)、高效的數(shù)字PCR油利用率方法，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的一個重要技術(shù)問題。