[發明專利]一種基于灰霉毒素倍半萜合酶BcBOT2基因的植物灰霉病分子檢測方法

在審

• 申請號: 201810913624.0
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108913806A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 王勇;高葦;張春祥;楊利娟;閻瑞香;張娜;張平
• 申請（專利權）人: 天津市植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種用于快速檢測植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）致病毒素Botrydial合成途徑中關鍵酶——倍半萜合酶的BcBOT2基因的特異性引物，其特征在于所述的引物對為正向引物BCbot2-F2和反向引物BCbot2-R2；

正向引物BCbot2-F2（5’ to3’）：GACTTCCATTTGGCTTCG；

反向引物BCbot2-R2 （5’ to3’）： TGTGCTAATACCCCGTCC。

2.權利要求1所述用于快速檢測植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）致病毒素Botrydial合成途徑中關鍵酶——倍半萜合酶的BcBOT2基因的特異性引物在用于植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）的快速檢測中的應用。

3.一種采用權利要求1所述用于快速檢測植物灰霉病病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）致病毒素Botrydial合成途徑中關鍵酶——倍半萜合酶的BcBOT2基因的特異性引物對植物灰霉病病原灰葡萄孢霉（B. cinerea）進行檢測的方法，其特征在于，提取待測樣品的DNA，然后通過聚合酶鏈式反應（PCR）的方法對待檢樣品DNA進行特異性擴增，確認是否存在擴增產物；所述的待測樣品為植物發病葉片、果實或真菌純培養物。

4.權利要求3所述的檢測方法， 其特征在于所述的通過PCR擴增的方法對灰葡萄孢霉（B. cinerea）的DNA進行特異性擴增，具體擴增體系總體積為25μL，包括2×taq MasterMix：12.5μL；引物BCbot2-F2：1μL；引物BCbot2-R2：1μL；ddH₂O：9.5μL和1μL DNA模板；其中2×taq Master Mix成分為：20 mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTPs，余量為滅菌ddH₂O。

5.權利要求3所述的檢測方法， 其特征在于；將配制好的反應液進行PCR擴增，反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，32個循環后；72℃延伸10min；擴增反應結束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件100V~110V，20min~30min，在337bp位置產生特異性條帶作為結果判定，產生特異性條帶表示檢測結果為陽性，存在植物灰霉病病原灰葡萄孢霉（B. cinerea），在337bp位置未存在特異性條帶表示檢測結果為陰性，不存在植物灰霉病病原灰葡萄孢霉（B. cinerea）。