[發明專利]一種單分子定位顯微成像方法、光學組件及成像系統

有效

• 申請號: 201810912834.8
• 申請日: 2018-08-10
• 公開（公告）號: CN108956575B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 于斌;王美昌;李四維;曹慧群;林丹櫻;屈軍樂
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/01
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙) 44268
• 代理人: 王永文;劉文求

本發明公開了一種單分子定位顯微成像方法、光學組件及成像系統，通過創建同時具有雙螺旋點擴散函數和變形多值純相位光柵多階成像性質的光學模塊；多個樣品面的待測分子發出的熒光光束通過所述光學模塊后在同一探測面的不同位置成像得到各自的雙螺旋圖像；根據所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置確定待測分子的橫向位置；根據所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中點及兩個旁瓣之間的連線的旋轉角度確定待測分子的軸向位置。可以將樣品內多個層面的分子信息以雙螺旋的形式成像在同一個探測面的不同位置，在無需掃描的情況下提高雙螺旋點擴散函數工程的軸向定位范圍和分辨率，解決活細胞內單分子定位和示蹤技術中的大景深探測難題。

技術領域

本發明涉及超分辨顯微成像技術領域，特別涉及一種單分子定位顯微成像方法、光學組件及成像系統。

背景技術

在生命科學技術飛速發展的今天，為了進一步了解和研究生命體之間的相互作用、疾病的產生機理，人們迫切需要獲得更加精確的細胞內部的結構信息。但是，由于光學衍射極限的存在，常規的光學顯微鏡的分辨率只能達到200nm左右，難以滿足現代生物醫學的需要。近年來，單分子定位超分辨熒光顯微技術的出現，如光敏定位顯微術(PLM)、隨機光學重建顯微術(STORM)、熒光光敏定位顯微技術(FPLM)等，它們克服了衍射極限，達到20nm的橫向分辨率和100nm的軸向分辨率，有力地推動了生命科學的發展，廣泛應用于生物醫學的各個領域。雖然單分子定位超分辨成像系統能夠實現超分辨成像,但是較低的軸向分辨率仍有待改善。為了克服這一問題，有研究人員在光路中加入柱面鏡，將單分子定位顯微的景深擴展到600nm；或者在探測光路中引入特殊相位，將點擴散函數變為雙螺旋的形式，實現熒光分子在軸向±2μm范圍內的三維定位；或者將探測光路分光并引入光程差，通過計算兩路光的光程差來獲得熒光分子的軸向位置，使成像景深達到1μm。雖然這些方法顯著地提升了單分子定位超分辨成像系統的成像景深，但對于厚度約10μm的完整細胞而言，現有的方法還不能滿足多分子追蹤時的大景深要求。

為了獲取整個細胞的信息，傳統方法是對同一細胞的不同軸向位置的層面進行一系列掃描探測，再由相關算法將所有層面信息按照軸向位置排序合成，還原出整個細胞內的分子信息。但是，在三維掃描的過程中，不同層面的信息會相互影響，產生背景噪聲和熒光漂白，降低分辨率。一些研究者提出使用變形光柵對樣品進行多層面探測，但由于變形光柵的能量主要分布在衍射的0級與±1級，故該方法最多只能對細胞內九個不同層面同時成像，因此，在實現大的軸向探測范圍的同時無法保持較高的軸向分辨率。

因而現有技術還有待改進和提高。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種單分子定位顯微成像方法、光學組件及成像系統，可以將樣品內多個層面的分子信息以雙螺旋的形式成像在同一個探測面的不同位置，在無需掃描的情況下提高雙螺旋點擴散函數工程的軸向定位范圍和分辨率，解決活細胞內單分子定位和示蹤技術中的大景深探測難題。

為了達到上述目的，本發明采取了以下技術方案：

一種單分子定位顯微成像方法，其包括如下步驟：

創建同時具有雙螺旋點擴散函數和變形多值純相位光柵多階成像性質的光學模塊；

多個樣品面的待測分子發出的熒光光束通過所述光學模塊后在同一探測面的不同位置成像得到各自的雙螺旋圖像；

根據所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置確定待測分子的橫向位置；

根據所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中點及兩個旁瓣之間的連線的旋轉角度確定待測分子的軸向位置。

所述的單分子定位顯微成像方法中，所述創建同時具有雙螺旋點擴散函數和變形多值純相位光柵多階成像性質的光學模塊的步驟包括：

對變形光柵進行相位編碼獲得多值相位形式的變形多值純相位光柵；