[發(fā)明專利]一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的主動脈縮窄標(biāo)志物檢測的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810911300.3 | 申請日： | 2018-08-11 |
| 公開（公告）號： | CN109030834A | 公開（公告）日： | 2018-12-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 莫緒明;徐誠;徐陽;束亞琴 | 申請（專利權(quán)）人： | 南京市兒童醫(yī)院 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68;G01N30/89 |
| 代理公司： | 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 湯東鳳 |
| 地址： | 210000 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 主動脈 縮窄 患兒 標(biāo)志物檢測 蛋白質(zhì)組學(xué) 誤診 蛋白標(biāo)志物 蛋白質(zhì)分析 特異性差異 常規(guī)超聲 蛋白定量 蛋白檢測 蛋白酶解 檢測結(jié)果 臨床實際 樣品蛋白 靈敏度 血清 制備 蛋白 檢查 驗證 應(yīng)用 | ||
1.一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的主動脈縮窄標(biāo)志物檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟1：樣品蛋白提取
用采血管抽取iTRAQ實驗血清標(biāo)本靜脈血，收集上層血清，低溫保存；
步驟2：蛋白定量
將稀釋的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品分別和蛋白定量染料避光反應(yīng)，同時測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的吸光值，計算各樣品蛋白濃度；
步驟3：蛋白酶解
通過還原劑、半胱氨酸阻斷劑、緩沖液、胰蛋白酶反應(yīng)，收集酶解后的樣品；
步驟4：iTRAQ標(biāo)記
取出iTRAQ試劑，加入異丙醇，將iTRAQ試劑添加到步驟3得到的樣品中反應(yīng)，確認(rèn)標(biāo)記后將樣品保存待用；
步驟5：高pH條件下的反相色譜分離
混合步驟4中保存的樣品，用試劑溶解，使用酶解好的BSA進(jìn)行分離，得到分離梯度數(shù)據(jù)；
步驟6：蛋白質(zhì)分析
將反相分離得到的組份用試劑復(fù)溶，吸取上清上樣，得到分離梯度數(shù)據(jù)，選擇數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜分析得到差異表達(dá)蛋白；
步驟7：檢測分析
經(jīng)iTRAQ檢出蛋白的數(shù)據(jù)，通過主動脈縮窄的疾病組與對照組對比，對比值小于特定值，認(rèn)為是蛋白表達(dá)下調(diào)，對比值大于特定值，認(rèn)為是蛋白表達(dá)上調(diào)；
步驟8：驗證
后續(xù)對所篩選出來的CTTN蛋白進(jìn)行大樣本的驗證。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的主動脈縮窄標(biāo)志物檢測的方法，其特征在于，所述步驟1具體包括如下步驟：iTRAQ實驗血清標(biāo)本用無添加劑的干燥真空采血管抽取靜脈血5-6ml，常溫下靜置1h，3000r/min離心10min，收集上層血清，置于凍存管液氮保存后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存待用，采用多重親和去除系統(tǒng)去除血清中的高豐度蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的主動脈縮窄標(biāo)志物檢測的方法，其特征在于，所述步驟2具體包括如下步驟：采用Bradford法測定提取的蛋白濃度，先將樣本用裂解緩沖液進(jìn)行一定倍數(shù)稀釋使其濃度落在標(biāo)曲范圍內(nèi)，稀釋好的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各取10μl分別與300μl蛋白定量染料避光反應(yīng)20min，用酶標(biāo)儀同時測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在595nm下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品每管吸光值和濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線公式計算各樣品蛋白濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的主動脈縮窄標(biāo)志物檢測的方法，其特征在于，所述步驟3具體包括如下步驟：
蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于離心管中；
加入4μl還原劑，60℃反應(yīng)1h；
加入2μl的半胱氨酸阻斷劑，室溫反應(yīng)10min；
將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中，12000r/min離心20min，棄掉收集管底部溶液；
加入iTRAQ試劑盒中的溶液緩沖液100μl，12000轉(zhuǎn)離心20min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3次；
換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量4μg，體積50μl，37℃反應(yīng)過夜；
次日，12000r/min離心20min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；
在超濾管中加入50μl溶解緩沖液，12000r/min再次離心20min，與上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的主動脈縮窄標(biāo)志物檢測的方法，其特征在于，所述步驟4具體包括如下步驟：
從冰箱中取出iTRAQ試劑，平衡到室溫，將iTRAQ試劑離心管底；
向每管iTRAQ試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底；
取50μl酶解后的樣品轉(zhuǎn)移到新的離心管中；
將iTRAQ試劑添加到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)2h；加入100μl水終止反應(yīng)；
從4組樣品中各取出1μl混合，脫鹽后進(jìn)行飛行質(zhì)譜鑒定，確認(rèn)標(biāo)記反應(yīng)良好；
混合標(biāo)記后的樣品，渦旋振蕩，離心至管底；
真空冷凍離心干燥，抽干后的樣品冷凍保存待用。
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