[發明專利]一種丙酮酸和左旋多巴聯產工藝與應用

有效

• 申請號: 201810907765.1
• 申請日: 2018-08-10
• 公開（公告）號: CN110055292B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 儲消和;林挺;吳黎誠;生英濤;陳萬河;程躍;徐順清;沈建;方明山;余煒;柳鵬福;孫俊杰
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;浙江綠創生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/22
• 分類號: C12P13/22;C12P7/40;C12R1/88
• 代理公司: 杭州賽科專利代理事務所(普通合伙) 33230
• 代理人: 尹建民

本發明涉及一種丙酮酸和左旋多巴聯產工藝與應用。采取如下的技術方案：(1)利用光滑球擬酵母發酵獲得丙酮酸料液，料液經過陶瓷膜除菌，超濾膜除蛋白、核酸、色素等大分子；(2)根據丙酮酸的摩爾量向丙酮酸濃縮液加入一定量的鄰苯二酚、醋酸銨、EDTA、亞硫酸鈉等化合物，調pH7.0?9.0，配制成酶催化底物溶液；(3)利用酪氨酸酚裂解酶基因工程菌發酵獲得酪氨酸酚裂解酶菌液，離心收菌體，高壓均質機破胞，離心，收集酶液；(4)酶液加入一定量的底物溶液，攪勻，25℃，密封震蕩反應；所述底物溶液為丙酮酸濃縮液配制,通過流加底物溶液控制鄰苯二酚的濃度0?10g/L，產物達到120g/L以上，停止流加底物溶液，當反應液中鄰苯二酚含量低于0.2g/L，停止反應。

技術領域

本發明涉及一種丙酮酸和左旋多巴聯產工藝與應用，屬于發酵與酶催化工藝領域。

背景技術

左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，簡稱L-DOPA)的化學名稱為3,4-二羥基苯基丙氨酸，其結構式為：

作為一種重要的生物活性物質，L-DOPA是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產物。

上世紀60年代，國外許多學者開始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。為了提高L-DOPA產量和底物轉化率，研究者們對微生物酶法合成L-DOPA的工藝方法進行了大量研究。

酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，該酶分子量約200kDa，是一個四聚體酶。TPL酶以磷酸吡哆醛(pyridoxal-phosphate，PLP)為輔酶，以鉀離子和氨離子為輔助因子，TPL可以催化L-酪氨酸發生β-消去反應生成苯酚、丙酮酸和氨。由于這個反應是可逆的，將鄰苯二酚代替苯酚后，可由鄰苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前體在較高濃度時對酶活都有抑制作用，其中鄰苯二酚及丙酮酸除了有強抑制作用外，還會導致酶的不可逆失活，反應條件難以控制，副產物多，L-DOPA的產率低。

印度R.KrishnaveniVandanaRathod等人利用真菌Acremoniumrutilum轉化L-酪氨酸至L-多巴，酪氨酸酶比活達1095U/mg。但目前產能較低，只有0.89g/L。

巴基斯坦Ikram-Ul-Haq等人對產酪氨酸酶的Aspergillusoryzae進行紫外誘變，誘變株最大產量達1.28g/L。

埃及Doaa A.R.Mahmoud·Magda A.El Bendary利用Egyptian halophilic blackyeast的酪氨酸酶轉化生成L-DOPA，產量為66μg/ml。

韓國研究人員使用酪氨酸酶進行轉化時，利用電取代還原試劑，將多巴醌(DOPAquinone)還原為L-多巴，使轉化率達95.9，生產強度47.27mg/L*h。

也有一些利用自然界中的細菌，如Escherichia、Proteus(變形菌屬)、Stizolobiumhassjoo和Erwinia(歐文氏菌屬)等，來合成L-DOPA，如左旋多巴酶法合成綜述報道，TPL大腸桿菌基因工程菌轉化30h，轉化生成29.6g/L的L-DOPA。又如，Jang-Young Lee等人克隆來源于Escherichia coli W(ATCC11105)的對羥基苯乙酸-3-羥基化酶(p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH)，轉化L-酪氨酸為L-DOPA，產物累積至10g/L。研究者發現這些重組菌株雖然TPL的表達量高于野生菌株，但最終的L-DOPA合成能力卻沒有明顯提高甚至低于野生菌株。這可能因為要獲得較高的L-DOPA合成能力，菌株除了具備TPL高活性外，還要有相對完善的底物、產物出入細胞膜的轉運機制以及對底物鄰苯二酚抑制酶活的耐受力等。總體來說，反應條件難以控制，穩定性差，副產物多，L-DOPA的產率低。