[發(fā)明專利]一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒及其構(gòu)建方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810902799.1 | 申請日： | 2018-08-09 |
| 公開（公告）號： | CN109182381A | 公開（公告）日： | 2019-01-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 寧志豐;劉濱磊;劉復(fù)興;吳基良;武倩 | 申請（專利權(quán)）人： | 湖北科技學(xué)院 |
| 主分類號： | C12N15/869 | 分類號： | C12N15/869;C12N15/66;C12N7/01;A61P35/00 |
| 代理公司： | 武漢荊楚聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42215 | 代理人： | 喻志勇 |
| 地址： | 437100 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 結(jié)腸癌細胞 溶瘤病毒 構(gòu)建 表達序列 基因組 剔除 免疫調(diào)節(jié)作用 特異性啟動子 免疫細胞 正常組織 結(jié)腸癌 啟動子 繁殖 病毒 受損 細胞 感染 | ||
1.一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟一、構(gòu)建pdICP4-promoter質(zhì)粒：PCR分別擴增I型單純皰疹病毒17+株ICP4基因啟動子上游和下游的側(cè)翼序列后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI/SpeI分別消化后獲得ICP4基因啟動子的上游側(cè)翼序列、下游側(cè)翼序列及去除ICP4啟動子的I型單純皰疹病毒17+株，并用互補的連接酶Linker 1和Linker 2將所述ICP4基因啟動子的上游側(cè)翼序列和下游側(cè)翼序列連接起來，并把連接后的產(chǎn)物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位點創(chuàng)建質(zhì)粒pdICP4-promoter；
步驟二、構(gòu)建pdICP4-CEA-promoter質(zhì)粒：用EcoRI/XhoI雙酶切消化的方式把由CMV啟動子控制的人CEA啟動子序列從質(zhì)粒pcDNA3.1-CEA-promoter中釋放出來，用T4DNA多聚酶處理后克隆入步驟一所得質(zhì)粒pdICP4-promoter的限制性內(nèi)切酶EcoHV酶切位點處，從而構(gòu)建質(zhì)粒pdICP4-CEA-promoter；
步驟三、BHK細胞內(nèi)同源重組I型單純皰疹病毒17+株：將步驟一中去除ICP4啟動子的I型單純皰疹病毒17+株與步驟二中質(zhì)粒pdICP4-CEA-promoter共同轉(zhuǎn)染BHK細胞，使這兩者在BHK細胞發(fā)生同源重組，獲得表達CEA啟動子的重組病毒載體17-d4-CEA-promoter；
步驟四、構(gòu)建pdICP34.5質(zhì)粒：PCR分別擴增I型單純皰疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游側(cè)翼序列，得到的ICP34.5上游和下游側(cè)翼序列兩個片段用重疊PCR進行連接，隨后把連接后的產(chǎn)物插入預(yù)先用限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI消化后的質(zhì)粒pSP72中，用T4DNA多聚酶補平質(zhì)粒的粘性末端，得到的質(zhì)粒命名為pdICP34.5；
步驟五、構(gòu)建質(zhì)粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代質(zhì)粒pcDNA3.1-CEA-promoter中的CEA-promoter，產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3.1-hIL-12；把來自質(zhì)粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表達盒克隆入質(zhì)粒pdICP34.5的Afel位點處，創(chuàng)建質(zhì)粒pdICP34.5-hIL-12；
步驟六、步驟五中的質(zhì)粒pdICP34.5-hIL-12用來刪除步驟三中重組病毒載體17-d4-CEA-promoter中ICP34.5基因，從而構(gòu)建出溶瘤病毒HSVCEA+IL-12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一中的ICP4啟動子中，
上游側(cè)翼序列的引物對包括：上游序列ICP4-promoterUSf為AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC；
下游序列ICP4-promoterUSr為AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT；
下游側(cè)翼序列的引物對包括：上游序列ICP4-promoterDSf為AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC；
下游序列ICP4-promoterDSr為AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒構(gòu)建方法，其特征在于，步驟四中的ICP34.5基因中，
上游側(cè)翼序列的引物對包括：上游序列ICP34.5USf為CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG；
下游序列ICP34.5USr為GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG；
下游側(cè)翼序列的引物對包括：上游序列ICP34.5DSf為GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA；
下游序列ICP34.5DSr為TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。
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