[發明專利]藍色犁頭霉中甾類11β-羥化酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201810902589.2
• 申請日: 2018-08-09
• 公開（公告）號: CN109097342B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 張學禮;陳晶;樊飛宇
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/19;C12P33/08
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了一種藍色犁頭霉中甾類11β?羥化酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的甾類11β?羥化酶為至少含有SEQ ID No.1的第19?527位，并且從SEQ ID No.1的第19位開始向SEQ ID No.1的N端延長，得到長度為509?526位氨基酸的任意一個蛋白質(Ac?CYP003蛋白)。另外本發明還提供了由甾類11β?羥化酶和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白質(Ac?CPR蛋白)組成的成套蛋白。本發明在異源微生物中表達Ac?CYP003蛋白(或其與Ac?CPR蛋白)，進行氫化可的松(HC)的催化合成，避免其他副產物的生成，提高了RSA到HC的轉化率。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及藍色犁頭霉中甾類11β-羥化酶及其編碼基因與應用。

背景技術

氫化可的松(Hydrocortisone，HC)化學名為11β,17α,21-三羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮，是腎上腺糖皮質激素藥物，在激素類藥物中占與重要地位，其結構式如圖1中所示。HC能夠影響糖代謝，具有抗病毒、消炎、抗過敏及抗休克等作用[Dumas,B.,et al.,Hydrocortisone made in yeast:metabolic engineering turns a unicellularmicroorganism into a drug-synthesizing factory.Biotechnol J,2006.1(3):299-307.]。主要用于腎上腺皮質功能不全引起的疾病及先天性腎上腺皮質功能增生等癥狀的治療，也可用于支氣管哮喘、類風濕性關節炎、痛風、風濕性發熱等炎癥性及過敏性疾病的治療，還可以用于嚴重性感染和抗休克治療等。

HC的合成方法主要分為三類：全化學合成法、半合成法及全生物合成的方法[Colingsworth,D.R.,et al.A partial microbiological synthesis ofhydrocortisone.Journal of Biological Chemistry 203.2(1953):807.]。1950年，Wendler等用化學全合成的方法經30多步化學反應成功合成HC，但因其工藝復雜，總收率太低，而無工業生產價值。Dumas等[Szczebara,F.M.,et al.,Total biosynthesis ofhydrocortisone from a simple carbon source in yeast.Nat Biotechnol,2003.21(2):143-149.]在釀酒酵母中使用人來源的11位β羥基化P450(CYP11B1)實現以葡萄糖為唯一碳源生物法全合成氫化可的松，但由于合成途徑復雜，產物得率較低也并沒有實現工業化生產。目前國內外制備HC等甾體藥物依然主要采用半合成的方法，即以薯蕷皂素或植物甾醇等前體通過化學合成獲得藥物中間體17α-羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Cortexolone-21-acetate,RSA)或11-脫氧皮質醇(11-deoxycortisol，RS)，然后通過犁頭霉菌(Absidia orchidis)和新月彎孢霉(Curvularia lunata)等微生物的生物全細胞催化反應對其11位進行β羥基化反應獲得HC[Kim,Y.H.,et al.,Synthesis of α-ketoglutarate using glutamate dehydrogenase combined with electrochemicalcofactor regeneration system.Journal of Bioscience and Bioengineering,2009.108:S45-S46.Manosroi,J.,Y.Chisti,and A.Manosroi,Biotransformation ofcortexolone to hydrocortisone by molds using a rapid color-developmentassay.Applied Biochemistry and Microbiology,2006.42(5):479-483.]。氫化可的松合成工藝見圖2。