[發明專利]HPV全長基因組質控品的制備方法、擴增引物及檢測試劑

有效

• 申請號: 201810902257.4
• 申請日: 2018-08-09
• 公開（公告）號: CN108929869B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 盧舟宇;田潔;陳永娟;陳志強;蔡澤加
• 申請（專利權）人: 亞能生物技術(深圳)有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6806;C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/70
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 張明

1.一種HPV全長基因組質控品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)獲得HPV的DNA模版；具體為：選取感染單一型別HPV的宮頸脫落細胞，通過PCR-反向點雜交法確定HPV型別，然后通過熒光PCR測定HPV的DNA濃度，選擇Ct值在25以下的樣本作為DNA模版；

(2)采用擴增HPV全長基因組的擴增引物進行PCR擴增，獲得包含HPV全長基因組的目的DNA片段，將獲得的目的DNA片段進行純化；所述擴增HPV全長基因組的擴增引物包括用于擴增HPV16型、HPV18型、HPV26型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV53型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型、HPV73型、HPV82型、HPV 6型、HPV 11型、HPV 42型、HPV 43型和HPV 81型全基因組的擴增引物，其核苷酸序列如SEQID No.1-46所示；所述引物的5’端增加與載體序列同源的15bp片段；

具體對應關系如下所示；

采用如上所述的HPV全長基因組擴增引物進行PCR的PCR反應體系如下所示：

擴增程序如下所示：

94℃下1min，1個循環；98℃下10sec且58℃下15sec且68℃下5min，60個循環；68℃下10min，1個循環；

所述PCR反應體系和擴增程序為每對引物針對單一型別HPV的DNA模版單獨進行擴增；

(3)采用HD Cloning連接技術將目的DNA片段與載體連接，構建獲得質粒；

(4)將質粒導入至感受態細胞中，然后提取質粒并驗證質粒與HPV各基因型別的序列是否匹配；

(5)采用人基因組稀釋質粒，獲得所述HPV全長基因組質控品。

2.根據權利要求1所述的HPV全長基因組質控品的制備方法，其特征在于，還包括步驟(6)：采用所述HPV全長基因組質控品、用于數字PCR檢測HPV全長基因組的試劑中的數字PCR引物和探針，進行PCR反應；

所述用于數字PCR檢測HPV全長基因組的試劑的數字PCR引物和探針包括用于檢測HPV16型、HPV18型、HPV26型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV53型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型、HPV73型、HPV82型、HPV 6型、HPV11型、HPV 42型、HPV 43型和HPV 81型的數字PCR上游引物、下游引物和探針，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.47-48、SEQ ID No.49-50和SEQ ID No.51所示。

3.根據權利要求2所述的HPV全長基因組質控品的制備方法，其特征在于，其特征在于，所述探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記MGB。

4.根據權利要求2所述的HPV全長基因組質控品的制備方法，其特征在于，步驟(6)中的PCR反應的反應體系為：

5.根據權利要求4所述的HPV全長基因組質控品的制備方法，其特征在于，步驟(6)中的PCR反應的擴增程序為：95℃下10min，1個循環；98℃下30sec且58℃下60sec，40個循環。

6.根據權利要求1所述的HPV全長基因組質控品的制備方法，其特征在于，測量獲得的HPV全長基因組質控品的核酸濃度。

7.根據權利要求1所述的HPV全長基因組質控品的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，將獲得的質粒于50℃條件下孵育15min，然后置于冰上。