[發明專利]一種富集培養法制備噬菌蛭弧菌制劑的方法

有效

• 申請號: 201810899734.6
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109097298B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 文傳敬;謝荔朋
• 申請（專利權）人: 福建九為生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/63
• 代理公司: 廈門知人匠心知識產權代理有限公司 35255
• 代理人: 吳慧敏

一種富集培養法制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，屬于生物技術領域。涉及多種蛭弧菌的富集法培養、宿主菌培養及其生物制劑的生產方法。其特征在于利用富集培養法培養的養殖水體中自然形成的蛭弧菌體系為生物制劑的蛭弧菌菌種來源，以養殖水體中的致病性弧菌經純化、培養、離心、滅活后做為生產蛭弧菌制劑的宿主菌來源，生產一種含有多種蛭弧菌的生物制劑。這種方法生產的蛭弧菌制劑，由于含有多種蛭弧菌，具有活性高、作用迅速、對水體中的病原菌裂解普廣等特性。

技術領域

本發明屬于微生物除菌技術領域，具體涉及一種富集培養法制備噬菌蛭弧菌制劑的方法。

背景技術

目前消除養殖水體中致病菌的方法主要以各種消毒劑和抗生素對水體進行消毒凈化處理，這種方法能夠迅速殺滅水體中的致病菌，但也殺滅了水體中的有益微生物，破壞了水體的微生態系統。長久的使用消毒劑及抗生素，導致致病菌的耐藥性逐年增強，使用消毒劑和抗生素最終不能有效的控制致病菌。

近年來，利用有益微生物控制水產養殖中的病原微生物越來越受到各方關注，尤其是噬菌蛭弧菌制劑，它具有有效的裂解養殖水體中的副溶血弧菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、沙門氏菌等致病性微生物，而且不使病原菌產生耐藥性，對人和動物無害等優點，備受人們關注。

目前市場上的蛭弧菌制劑是以經過篩選純化后的單一的、或人工復配的多株純化后的蛭弧菌來生產，其工藝較為繁復，批次生產周期長、成本大。譬如專利申請號為201610513338.6的技術專利，提供了一種嗜菌蛭弧菌的生產方法，名稱為“一種嗜菌蛭弧菌的生產方法”、專利申請號為93111749.6的技術專利，提供了一種嗜菌蛭弧菌的生產方法，名稱為“生物制菌王及其生產方法”、專利號為00129401.6的技術專利，專利名稱為“嗜菌蛭弧菌生物制劑及其生產方法”，提供了一種無宿主菌生產噬菌蛭弧菌的方法。上述生產蛭弧菌制劑所用蛭弧菌都是經過純化后獲得的單一的蛭弧菌菌株做為菌種，而養殖水體中通常同時具有多種致病菌，單一蛭弧菌菌株對多種致病菌的裂解能力是有限的，故存在應用效果不明顯等問題。本發明克服了上述缺點，以本技術制備的蛭弧菌制劑應用于養殖水體，對于多數致病性微生物具有較強的裂解效果。

發明內容

本發明的目的是提供一種以養殖水體中富集培養采集的多種蛭弧菌用于生產蛭弧菌制劑的方法。

本發明的具體方案如下：一種富集培養法制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：宿主菌的分離：以TCBS選擇性培養基培養分離并純化養殖水體水樣中的弧菌，并做為制備噬菌蛭弧菌制劑的宿主菌菌種；

步驟二：宿主菌濃懸液的制備：將步驟一純化后的弧菌在液體培養基中培養至弧菌生長的穩定期后，得到發酵液；發酵液經離心分離去掉發酵液培養基，將余下弧菌菌體的菌泥以等體積的滅菌海水稀釋，做水浴熱滅活處理，獲得滅活宿主菌濃懸液；

步驟三：噬菌蛭弧菌的富集培養：將過濾除菌后的養殖水體水樣加入步驟二制備的滅活宿主菌濃懸液，搖床培養至液體由渾濁轉為清澈，即為噬菌蛭弧菌富集培養液；

步驟四：噬菌蛭弧菌母液的制備：取步驟三制備的蛭弧菌富集培養液與步驟二制備的滅活宿主菌濃懸液，制備雙層平板，培養至出現噬菌斑并融合后，加入滅菌海水浸泡，即為由多種蛭弧菌混合的蛭弧菌母液。

步驟五：噬菌蛭弧菌制劑的制備：將步驟四的蛭弧菌母液與滅活宿主菌懸浮液進一步擴大培養，得到蛭弧菌母液擴大液；按比例將滅活宿主菌濃懸液、蛭弧菌母液擴大液加入過濾除菌海水中，即為噬菌蛭弧菌制劑。

進一步的，所述的一種富集培養法制備噬菌蛭弧菌制劑的方法，其具體工藝流程如下：