[發(fā)明專利]一種提高基因突變檢測靈敏度的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810899234.2
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN108998504A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鮑偉勝;王春雷
• 申請（專利權(quán)）人: 鮑偉勝;王春雷
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827
• 代理公司: 合肥天明專利事務(wù)所(普通合伙) 34115
• 代理人: 趙瑜;奚華保

本發(fā)明涉及基因突變檢測技術(shù)，具體涉及一種提高基因突變檢測靈敏度的方法，包括以下幾個步驟：S1、靶向DNA序列的PCR擴(kuò)增；S2、PCR產(chǎn)物的純化；S3、突變型特異性引物的延伸；S4、突變型基因DNA片段的雜交和富集。與傳統(tǒng)的用作基因突變檢測的ASPE技術(shù)不同，本發(fā)明的突變型特異性引物的延伸反應(yīng)體系中，只加入突變型的前向引物和未標(biāo)記的dNTPs；并且在突變型基因DNA片段的雜交后，通過核酸的變性和復(fù)性過程，而富集突變型基因DNA片段。該方法除去測序體系中占有主要部分的野生型基因DNA片段，富集了突變型基因DNA片段，顯著的提高Sanger和NGS測序的靈敏度，理論上的提高能夠達(dá)到100倍的數(shù)量級。本發(fā)明既可以富集單個的突變基因位點(diǎn)，又可以同時富集多個突變基因位點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因突變檢測技術(shù)，具體涉及一種提高基因突變檢測靈敏度的方法。

背景技術(shù)

癌癥有許多原因，但最終所有這些原因都對一類稱為癌癥基因或原癌基因的特殊基因起作用。癌基因通常執(zhí)行基本的細(xì)胞功能，與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂有關(guān)。然而，原癌基因也可轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳┗颉Ｔ┗蚩梢赞D(zhuǎn)變成其致癌(基因)狀態(tài)的主要方式之一是通過基因突變。自發(fā)或環(huán)境誘發(fā)的突變發(fā)生在單個細(xì)胞的原癌基因中，然后經(jīng)歷多個細(xì)胞分裂形成腫瘤。

在癌癥患者中，凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞釋放他們的DNA內(nèi)容到血液里，這通常稱為循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。液態(tài)活檢技術(shù)可以從人體血漿中獲得ctDNA，使用DNA測序或分子基因分型檢測以鑒定和定量測量ctDNA攜帶體細(xì)胞基因突變的分子，對ctDNA基因突變的檢測有著重要的作用。特定的基因突變可能表明某些類型腫瘤的存在，從而減少了對侵入性的組織活檢的需求。定量監(jiān)測ctDNA中的基因突變可以提供有關(guān)腫瘤患者在治療期間的腫瘤負(fù)載的信息。此外，根據(jù)特定基因的突變情況，為腫瘤患者提供治療方案，如直腸癌患者，KRAS基因的突變預(yù)示該患者對抗表皮生長因子受體單克隆抗體治療效果很差。

目前ctDNA基因突變的分析方法包括下一代靶向測序(Next GenerationSequencing,NGS)和熒光探針的ddPCR。無論采用何種方法，對ctDNA基因突變的檢測均存在挑戰(zhàn)。血液中的DNA高度分裂成低分子量的DNA，平均小于200bp。ctDNA與正常DNA混雜在一起，因而，腫瘤DNA被來自正常細(xì)胞的DNA嚴(yán)重稀釋，其含量可能低至0.01％。更為嚴(yán)重的是，每個突變等位基因在數(shù)目上明顯的不敵幾乎相同的野生型等位基因，數(shù)量比超過1比10,000。過多的野生型基因易導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，并且使低含量的突變信號與噪音無法區(qū)分。下一代靶向測序的靈敏度大約是0.1％，對于低于0.1％的基因突變NGS則不能準(zhǔn)確的檢測出。因此，需要一種新的技術(shù)，能夠盡可能的把含量豐富的野生型等位基因從ctDNA或循環(huán)的無細(xì)胞DNA(cfDNA)中分離出來，從而富集和提高突變基因的含量，便于NGS準(zhǔn)確的測序。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高基因突變檢測靈敏度的方法。

ctDNA含量偏低和突變型基因被大量野生型基因所遮蔽是影響基因突變檢測靈敏度的主要因素。ctDNA含量的高低取決于腫瘤的負(fù)載和患者的治療情況。在同一個反應(yīng)體系中分離出野生型基因，從而富集突變型基因，有利于NGS的準(zhǔn)確測序。利用PCR技術(shù)對靶向DNA序列進(jìn)行放大擴(kuò)增，這樣野生型和突變型基因DNA序列均得到信號的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后，再進(jìn)行第二次的PCR的擴(kuò)增。但這次的擴(kuò)增僅針對于突變型基因，利用突變型的引物來進(jìn)行。只有該引物3′末端堿基與基因突變的SNP位點(diǎn)完全堿基配對后，引物才能與模板結(jié)合和延伸。同時，突變型引物的5′末端有用于雜交用的Tag片段序列或者生物素。羧基磁珠、DNA芯片或其它的固態(tài)物質(zhì)的表面均有抗Tag的序列或者鏈霉親和素。利用Tag和抗Tag的堿基配對作用或者鏈霉親和素與生物素的天然親和力作用，把擴(kuò)增后的突變型與野生型的基因DNA片段分開，從而達(dá)到富集突變型基因DNA片段的作用。該富集的效率可達(dá)到幾千倍。

該方法有以下幾個步驟：