[發(fā)明專利]一種檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR引物、探針、試劑盒及方法

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• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109055503A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設計）人: 李寧;陸小梅;彭琪;黎四平;何曉光;李文瑞
• 申請（專利權）人: 東莞市第八人民醫(yī)院;東莞市兒科研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 44215
• 代理人: 姜華

1.一種檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR引物，其特征在于：所述引物包括用于擴增BCL2L1基因的引物F1和引物R1、以及用于擴增對照基因GADPH的引物F2和引物R2，所述4條引物的核苷酸序列分別為：

F1：5’-CTGACCATCCACTCTACCCT-3’

R1：5’-GGTTCTCCTGGTGGCAAT-3’

F2：5’-TGCCATCAATGACCCCTTC-3’

R2：5’-ACAAGCTTCCCGTTCTCAT-3’。

2.一種檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述探針包括用于檢測BCL2L1基因的探針Probe1和用于檢測對照基因GADPH的探針Probe2，所述探針Probe1的核苷酸序列為：5’-CCCTTCTCTGCTCCACCACATCCTC-3’，所述探針Probe2的核苷酸序列為：5’-CCTTGACGGTGCCATGGAATTTGC-3’，所述探針Probe1和探針Probe2的5’端均標記熒光基團，3’端均標記淬滅基團。

3.根據(jù)權利要求2所述的一種檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述探針Probe1的5’端標記熒光基團FAM，3’端標記淬滅基團BHQ1。

4.根據(jù)權利要求2所述的一種檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述探針Probe2的5’端標記熒光基團VIC，3’端標記淬滅基團BHQ1。

5.一種檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權利要求1所述的引物和權利要求2-4任一項所述的探針。

6.一種用于非治療目的的檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)提取樣本RNA：分別提取正常血液樣本S1和患者血液樣本S2的RNA，標記為S1-RNA和S2-RNA；

(2)反轉錄：將提取的正常血液樣本S1和患者血液樣本S2的RNA分別反轉錄成cDNA，標記為S1-cDNA和S2-cDNA；

(3)熒光定量PCR：使用FAM和VIC雙通道實時熒光定量RT-PCR分別檢測上述S1-cDNA和S2-cDNA，通過檢測的Ct值定量計算出血清樣品中BCL2L1中mRNA的含量。

7.根據(jù)權利要求6所述的一種檢測BCL2L1中mRNA的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述步驟(1)具體為：

(1.1)將正常血液樣本S1和患者血液樣本S2室溫放置5-10min，使得核蛋白與核酸完全分離；

(1.2)分別加入0.15-0.25mL氯仿，劇烈振蕩10-20s，室溫放置2-4min；然后在3-5℃溫度下以10000-1400rpm轉速離心8-12min；

(1.3)分別吸取上層水相轉移至干凈的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置15-25min；然后在3-5℃溫度下以10000-1400rpm轉速離心8-12min，棄上清；

(1.4)分別加入0.8-1.2mL質量分數(shù)為70％-80％的乙醇洗滌沉淀，然后在3-5℃溫度下以10000-1400rpm轉速離心2-4min，棄上清，室溫干燥5-10min；

(1.5)分別加入30-50μL RNase-free ddH₂O，充分溶解RNA，將所得到的S1-RNA和S2-RNA溶液置于-70℃保存或用于后續(xù)試驗。