[發(fā)明專利]用于結核分枝桿菌復合群檢測的核酸序列、試劑盒及檢測方法和應用

有效

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• 申請日: 2018-08-07
• 公開（公告）號: CN110819724B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設計）人: 趙雁林;劉東鑫;程倩;溫永俊;李宇宏;鄭利英
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心;內蒙古華星康為生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙) 11390
• 代理人: 胡劍輝

本發(fā)明涉及細菌檢測領域，具體講，涉及一種用于結核分枝桿菌復合群檢測的核酸序列、試劑盒及檢測方法和應用。本發(fā)明用于結核分枝桿菌復合群檢測的核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置換擴增反應引物序列。本發(fā)明的多交叉置換擴增反應引物序列可針對特異性基因MPB64結核分枝桿菌復合群進行檢測。本發(fā)明試劑盒及檢測方法具有低檢測下限、高靈敏度、高特異性，以及簡單、快速、準確、易操作的技術優(yōu)勢。

技術領域

本發(fā)明涉及細菌檢測領域，具體講，涉及一種用于結核分枝桿菌復合群檢測的核酸序列、試劑盒及檢測方法和應用。

背景技術

結核分枝桿菌(Mycobacterium tubercμLosis，MTB)是引起結核病的重要病原菌。在全球引起死亡的原因中排名第九，根據世界衛(wèi)生組織2017年的報道，我國在全球結核病高負擔國家中發(fā)病率僅次于印度和印度尼西亞排在第三位。2016年我國結核病患者估算約為89.5萬，新發(fā)的MDR(耐多藥結核病)和RR-TB(利福平耐藥結核病)患者達7.3萬。因此，結核病是我國重點控制的重大傳染病之一。

結核病可通過空氣，主要引起人及動物肺部感染。肺結核癥狀表現為咯血、氣胸、胸腔積液、呼吸衰竭等癥狀，嚴重威脅著患者的生命安全。結核病患者咳嗽或者打噴嚏產生含有結核分枝桿菌的飛沫，在人口密集空氣流通較差的公共場所如醫(yī)院、工廠、學校容易引起暴發(fā)。近年來由結核病引發(fā)的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，特別是學校聚集性疫情及口岸事件的發(fā)生，引起了社會的廣泛關注及恐慌。結核病的診斷是結核病疫情防控的首要環(huán)節(jié)，只有快速準確的確診結核病患者才能進一步對患者進行精確的治療及隔離。因此，為了給予臨床病人準確快速的治療以及避免結核病疫情的擴散，研發(fā)一個快速、簡便和準確的結核分枝桿菌檢測方法是很有必要的。

目前對于結核分枝桿菌的檢測主要依靠抗酸涂片法(萋尼法和熒光染色法)和培養(yǎng)法，涂片法雖然簡便易行，但是其靈敏度較低；培養(yǎng)法雖然具有靈敏度較高，但是獲得結果的周期太長，操作繁瑣并且容易造成生物安全事件。由此以上兩種方法均難以滿足臨床及檢疫檢驗的要求。隨著核酸診斷技術的快速發(fā)展，一些以PCR為基礎的診斷技術(如GeneXpert MTB/RIF，基因芯片)被用于結核分枝桿菌的快速檢測，然而這些方法依賴昂貴的儀器設備，并且反應的成本較高，這些都限制它們的廣泛推廣使用。

隨著恒溫技術的出現，環(huán)介導恒溫擴增技術(LAMP)及交叉恒溫擴增技術(CPA)已經應用于結核分枝桿菌的快速檢測，其中LAMP技術在擴增反應后，需要在特定的儀器中讀取變色反應結果，增加了檢測步驟及儀器成本，不利于該技術的推廣。將CPA技術結合免疫層析乳膠標記試紙條檢測技術可以避免對儀器的依賴，但是該種方法需要開蓋操作，極易造成后續(xù)檢測試驗的假陽性結果。

多交叉置換擴增(MμLtiple Cross Displacement Amplification，MCDA)是一種新型核酸擴增技術，具有擴增速度快、反應靈敏、特異性高等優(yōu)點。該技術已被廣泛用于分子診斷領域。MCDA針對靶序列10個特異部位設計10條引物，利用具有鏈置換活性的Bst2.0DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶序列高效擴增。10條引物中2條為置換引物F1和F2；2條交叉引物，即CP1和CP2；6條擴增引物，即C1和C2，D1和D2，R1和R2。交叉引物包含CP1包含C1和P1，即5’-C1-P1；CP2包含C2和P2,即5’-C2-P2。MCDA擴增反應包括兩個過程，即擴增引物介導的循環(huán)擴增和交叉引物介導的置換擴增。

插入序列IS6110是僅存在于結核分枝桿菌符合群中(MTBC)的特異性基因，但研究表明部分MTBC菌株基因組中的IS6110基因為0拷貝，因此針對IS6110基因的檢測結核分枝桿菌的方法可能產生假陰性結果，造成漏診。因此，創(chuàng)建一種基于其他結核分枝桿菌符合群特異基因的檢測方法彌補當時方法的不足是很有必要的。

發(fā)明內容

本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出一種用于結核分枝桿菌復合群檢測的核酸序列。