[發(fā)明專利]芽孢形成相關(guān)基因sigmaF在產(chǎn)酶中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810885928.0
• 申請日: 2018-08-06
• 公開（公告）號: CN108949784B
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖靜;王瑞明;原梨萍
• 申請（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/75;C12N9/42
• 代理公司: 37219 濟(jì)南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 陳桂玲

1.芽孢形成相關(guān)基因sigmaF在產(chǎn)酶中的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下：

(1)提取克勞氏芽孢桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得克勞氏芽孢桿菌芽孢形成相關(guān)基因sigmaF，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以pHT01質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得Cm^r片段，所述Cm^r片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

(3)采用重疊PCR技術(shù)將步驟(1)獲得的基因sigmaF與步驟(2)獲得的Cm^r片段進(jìn)行融合，制得融合基因sigmaF-Cm^r，所述融合基因sigmaF-Cm^r的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(4)將步驟(3)制得的融合基因sigmaF-Cm^r經(jīng)酶切后，濃縮，轉(zhuǎn)化克勞氏芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選得陽性重組菌，即可應(yīng)用于產(chǎn)酶；所述濃縮后的融合基因sigmaF-Cm^r的濃度為300～500ng/μL；

所述產(chǎn)酶為產(chǎn)纖維素酶，纖維素酶的酶活為出發(fā)菌株的3～4倍。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)中，所述PCR擴(kuò)增的引物核苷酸序列如下，下劃線為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)：

sigmaF-F：CGCGGATCCATGAGTGCAGAGGTGAAAAACAGCGG，

sigmaF-R：GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAATGAGTGGTCGGCAAT；

PCR擴(kuò)增體系如下，總體積50μL：

2×HiFi-PCR Master 25μL，上游引物sigmaF-F 2.5μL，下游引物sigmaF-R 2.5μL，克勞氏芽孢桿菌基因組DNA 2.5μL，ddH₂O 17.5μL；

PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min15s，共30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min。

3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的引物核苷酸序列如下，下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)：

Cm^r-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC，

Cm^r-R：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGG；

PCR擴(kuò)增體系如下，總體積50μL：

2×HiFi-PCR Master 25μL，上游引物Cm^r-F 2.5μL，下游引物Cm^r-R 2.5μL，pHT01質(zhì)粒2.5μL，ddH₂O 17.5μL；

PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min45s，共30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min。