[發明專利]一種組培用油菜種子的滅菌方法

在審

• 申請號: 201810874260.X
• 申請日: 2018-08-03
• 公開（公告）號: CN109220788A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 傅淑;楊廣;劉昭霞;陳金芝;孫庚曉;尤民生
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A61L2/18
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明公開了一種組培用油菜種子的滅菌方法，先將種子放在水中浸泡1 h，去除浮在水面上的種子，自來水沖洗2遍，轉移至超凈工作臺內，75%酒精處理消毒1 min，用3%NaClO滅菌種子15min（期間保持晃動轉態），再用無菌水沖洗5?6次，最后將種子轉移至無菌濾紙上晾干即可。其中，3%NaClO是從0%?30%NaClO滅菌種子效果中篩選出的最佳滅菌濃度，滅菌15min是用最佳濃度3%NaClO滅菌種子10min?30min中篩選到的最佳滅菌時間。本發明可以獲得最多的健康苗用于轉基因油菜的生產，從而提高油菜基因轉化的成功率。

技術領域

本發明涉及植物組織培養領域，具體涉及一種組培用油菜種子的滅菌方法。

背景技術

油菜屬十字花科蕓苔屬植物，是一種重要的油料作物，其產品既可以加工成人類食用油、工業潤滑油，也可以作為綠肥和堆肥。據報道，在2014-2015年間，全球的菜籽油產量超過269.8萬噸，為第三大產油植物。通過轉基因技術快速獲得理想性狀油菜栽培種，現在已被廣泛使用，據國際農業生物技術應用服務組織（ISAAA）統計，2016年轉基因作物種植面積達1.851億公頃，且全球種植的油菜有24%為轉基因品種（http://www.isaaa.org），獲得轉基因油菜的普遍做法是農桿菌介導轉化法，通過組織培養獲得轉基因油菜，而組織培養技術的第一步就是油菜種子的無菌化處理，種子滅菌是轉基因油菜成功的關鍵。

目前使用最多的油菜種子滅菌劑為次氯酸鈉（NaClO），值得注意的是如果使用的NaClO濃度過低或滅菌時間不夠，種子滅菌就不徹底，播種后容易滋生病原菌，苗容易被病原菌感染；濃度過高或滅菌時間過久，則會損傷種子，令種子發芽不正常甚至無法發芽，無法獲得足夠的苗用于轉基因研究，而目前報道的NaClO使用濃度從0.1%到50%，滅菌時間從6min到45 min不等，這為轉基因油菜研究的應用推廣帶來了極大的困難。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明旨在提供一種組培用油菜種子的滅菌方法，用不同濃度的NaClO滅菌油菜種子不同時間來篩選出最適合的種子滅菌濃度和滅菌時間，提高油菜種子滅菌效率。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種組培用油菜種子的滅菌方法，包括如下步驟：

（1）先將組培用油菜種子放在水中浸泡1 h，去除浮在水面上的種子；

（2）用自來水沖洗2遍；

（3）用75%酒精處理消毒1 min；

（4）用0% - 30% NaClO滅菌10 - 30 min；

（5）用無菌水沖洗5 - 6次，最后用無菌濾紙吸去種子上的水份；

（6）將種子播種到MS種子萌發培養基上；

（7）播種5日后，統計種子發芽率、健康芽率和菌落數。

優選的，步驟（4）中，NaClO濃度為3%，滅菌種子時間為15 min。

步驟（6）中，MS種子萌發培養基為：MS 培養基2.22 g/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂粉8g/L，pH值為5.8。

步驟（6）中，培養環境為：25℃、相對濕度60% - 70%，前2日全暗處理，后3日2000lx光照16 h/日。

本發明的優點在于：

本發明處理方法通過比較目前報道的NaClO滅菌濃度和時間，得到了用NaClO滅菌油菜種子的最佳濃度和時間，在節約了NaClO的使用成本的同時，又節省了種子滅菌的操作時間，在不影響種子發芽率的基礎上，又可以獲得最多的健康芽率，獲得足夠的健康苗用于油菜的轉基因研究。本發明為油菜的遺傳轉化研究奠定了堅實的基礎，可以提高油菜轉基因用的外植體數量，從而提高遺傳轉化的效率。