[發明專利]一種快速檢測鐮刀菌DNA的方法

在審

• 申請號: 201810869124.1
• 申請日: 2018-08-02
• 公開（公告）號: CN108949915A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 高飛;張曉婷;周琳;許娟;杜鵬強;張艷麗;謝源;李洪連
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/04
• 代理公司: 福州科揚專利事務所 35001
• 代理人: 林朝熙

本發明涉及一種快速檢測鐮刀菌DNA的方法，其包括以下步驟：S1：提供特異性識別鐮刀菌DNA的DNA分子機器，所述DNA分子機器為一條包含G?四鏈體互補序列的核苷酸序列；S2：將所述DNA分子機器與待測樣品相互混合；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子機器，發生DNA擴增反應；S4：引入硫黃素T，誘導產生G?四鏈體結構，并與G?四鏈體結合，產生熒光；檢測和記錄該熒光。本發明可將疑似含有鐮刀菌DNA的小麥待測樣品中的核酸信號轉化為G?四鏈體，在常溫恒溫下即可實現G?四鏈體的不斷擴增，將核酸的信號高度放大，通過硫黃素T結合G?四鏈體產生穩定的熒光信號，從而實現高靈敏度的核酸快速定性分析測定。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速檢測鐮刀菌DNA的方法。

背景技術

鐮刀菌是一類世界性分布的真菌，它不僅可以在土壤中越冬越夏，還可侵染多種植物(糧食作物、經濟作物、藥用植物及觀賞植物)，引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害，寄主植物達100余種，侵染寄主植物維管束系統，破壞植物的輸導組織維管束，并在生長發育代謝過程中產生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產量和品質，是生產上防治最艱難的重要病害之一。

目前，對于鐮刀菌的檢測的等溫可視為檢測，大多利用環介導等溫擴增測定或者通過PCR法測定。

盡管恒溫擴增技術以其恒溫優勢以及擴增效率高的特點得到廣泛重視，但恒溫擴增產物的檢測未能突破熒光染料嵌入進行實時分析或凝膠電泳進行終點分析等傳統的核酸擴增檢測方法，真正意義上實現快速、簡單、便攜地檢測核酸。

傳統的熒光標記核酸擴增檢測技術，需要進行熒光探針標記，操作繁瑣，費時又昂貴并且其靈敏度不高。依托傳統技術構建的熒光傳感器雖然背景信號低，穩定性強，然而，由于實際樣本成分復雜，靶標DNA含量極低，這就要求檢測方法具有極高的靈敏度和特異性，常規的熒光標記核酸擴增檢測技術的靈敏度和選擇性無法滿足其檢測需求。

G-四鏈體(G-quadruplex)是由富含串聯重復鳥嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的高級結構。G-四鏈體(G-quartet)是四鏈體的結構單元，由Hoogsteen氫鍵連接4個G形成環狀平面，兩層或以上的四鏈體通過π-π堆積形成四鏈體。

硫黃素T(ThioflavinT，ThT)是一種水溶性熒光染料，自身熒光信號很低，但在單鏈、雙鏈或三鏈DNA/RNA與G-四鏈體同時存在時，硫黃素T(ThioflavinT，ThT)能夠區分不同的核酸類型，對G-四鏈體具有很強的結構選擇性，與G-四鏈體結合并產生更加穩定的熒光。

發明內容

(一)要解決的技術問題

為了解決現有技術的上述問題，本發明提供一種G-四鏈體分子機器及核酸檢測方法。G-四鏈體生成機器識別靶序列，并在靶序列的牽引之下擴大生成G-四鏈體，與硫磺素結合產生穩定的熒光，從而將靶序列信號擴大，達到定性的效果。無需熒光探針標記，靈敏度更高，操作更簡單。

(二)技術方案

為了達到上述目的，本發明采用的主要技術方案包括：

一種快速檢測鐮刀菌DNA的方法，其包括以下步驟：

S1：提供特異性識別鐮刀菌DNA的DNA分子機器，所述DNA分子機器為包括G-四鏈體互補序列的核苷酸序列；

S2：將所述DNA分子機器與待測樣品相互識別；

S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子機器，發生DNA擴增反應；

S4：引入硫黃素T，誘導產生G-四鏈體結構，并與G-四鏈體結合，產生熒光；

S5：記錄熒光發光情況。