[發(fā)明專利]一種檢測miRNA的方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810869050.1
• 申請日: 2018-08-02
• 公開（公告）號: CN109097446A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張芳;梁淑英;陳雨濃;陳雪雲(yún);張曉婷;高飛
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12Q1/682
• 代理公司: 福州科揚專利事務(wù)所 35001
• 代理人: 林朝熙

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測miRNA的方法，包括：S1：提供特異性識別miRNA的DNA分子機器，所述DNA分子機器為包含G?四鏈體序列的互補序列的一條核苷酸序列；S2：將所述DNA分子機器與待測樣品相互識別；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子機器；S4：引入硫黃素T，誘導(dǎo)產(chǎn)生G?四鏈體結(jié)構(gòu)并與G?四鏈體結(jié)合，產(chǎn)生熒光；S5：記錄熒光發(fā)光情況。所述DNA分子生成機器為一條核苷酸序列，包括從3’端到5’端依次排列的區(qū)域，即：miRNA序列識別區(qū)、穩(wěn)定區(qū)、切口酶識別區(qū)和G?四鏈體合成模板。本發(fā)明無需熒光探針標(biāo)記，靈敏度更高，操作更簡單。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測miRNA的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達與多種癌癥相關(guān)，大約50％得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(fragilesite)。這說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人員將miRNA命名為“oncomirs”。原發(fā)性肝癌中存在一些異常表達的miRNA，它們多靶向于肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和信號通路，miRNA表達譜還與肝癌病理類型、惡性程度、分期、分級等臨床病理過程密切相關(guān)，miRNA可作為肝癌判斷預(yù)后的工具。

目前關(guān)于miRNA的檢測，所采用的恒溫擴增技術(shù)，大多需要進行熒光標(biāo)記核酸擴增檢測，未能突破熒光染料嵌入進行實時分析或凝膠電泳進行終點分析等傳統(tǒng)的核酸擴增檢測方法，未能真正意義上實現(xiàn)快速、便攜地檢測核酸。

對比專利1：

申請?zhí)枮镃N102618664A，專利名稱為：一種MiRNA檢測探針和可視化檢測MiRNA的方法，其中公開一種miRNA檢測探針，包括三個部分：靠近3'端為G-四鏈體形成序列，中間是待測靶標(biāo)互補序列，5'端為干擾序列；所述G-四鏈體形成序列含有4段GGG序列參與G-四鏈體形成；所述待測靶標(biāo)互補序列為loop環(huán)，與相應(yīng)的靶miRNA完全互補；所述干擾序列有5-10個與G-四鏈體形成序列互補的堿基。其中，在具體的檢測方法中是在鈉鉀粒子及血紅素的共同作用下，以過氧化物酶催化顯綠色色反應(yīng)，從而實現(xiàn)可視化檢測，且所使用的探針及方法，減少了復(fù)雜熒光標(biāo)記的環(huán)節(jié)。

對比專利2：

申請?zhí)枮镃N106967794A，專利名稱為：雙向信號擴增檢測miRNA的試劑盒及方法，其中提到試劑盒包括：(1)第一發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA探針，所述第一發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA探針能夠與所述miRNA堿基配對，從而打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)；(2)第二發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA探針，所述第二發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA能夠與miRNA競爭結(jié)合所述第一發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA探針，從而釋放miRNA，并且，所述第二發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA探針與所述第一發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA探針形成的DNA復(fù)合體具有至少一個粘性末端；(3)環(huán)狀DNA探針，所述環(huán)狀DNA探針中的一段連續(xù)堿基與DNA復(fù)合體的一個粘性末端互補，并且，所述環(huán)狀DNA探針與所述DNA復(fù)合體能夠通過滾環(huán)擴增得到含有多G重復(fù)序列的G四聯(lián)體擴增產(chǎn)物。其原理是設(shè)計雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)通過檢測物靶序列的引入，在DNA聚合酶和dNTPS的作用下進行滾環(huán)擴增的方式產(chǎn)生大量的G四聯(lián)體與THT熒光染料相互識別，從而實現(xiàn)定性和定量。但是，該發(fā)明需要設(shè)計雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)在滾環(huán)擴增的過程中容易發(fā)生錯位配對，降低檢測的靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

(一)要解決的技術(shù)問題