[發(fā)明專利]一種畢赤酵母高效基因敲除方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810853635.4
• 申請(qǐng)日: 2018-07-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109082444A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李莉玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/90;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 惠州市超越知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44349
• 代理人: 陳文福;陳惠珠

本發(fā)明提供一種畢赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，包含以下步驟：S1.通過(guò)質(zhì)粒pYES2構(gòu)建敲除質(zhì)粒pGE1203?ADE?URA3；S2.將敲除質(zhì)粒分別敲入所述畢赤酵母組中目標(biāo)基因och 1的上游、下游；S3.具有敲除質(zhì)粒活性的蛋白質(zhì)識(shí)別、剪切所述核苷酸序列，敲除所述目標(biāo)基因och 1，獲得敲除所述目標(biāo)基因och 1的畢赤酵母。本發(fā)明有效改善畢赤酵母對(duì)蛋白的糖基化修飾，解決融合蛋白過(guò)度糖基化的問(wèn)題，對(duì)畢赤酵母och1基因進(jìn)行了高效敲除。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種畢赤酵母高效基因敲除方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)，隨著基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，眾多目的基因在原核和真核細(xì)胞中被克隆和表達(dá)出來(lái)，以此提高外源蛋白的表達(dá)能力。長(zhǎng)期以來(lái)，大腸桿菌一直被用作表達(dá)外源基因的宿主菌，并成功地表達(dá)了多種外源蛋白，但是它不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)，且分泌型表達(dá)產(chǎn)量較低。而酵母作為一種表達(dá)外源基因的宿主菌，既具有原核生物生長(zhǎng)特性、操作簡(jiǎn)單，又具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾加工特性。在表達(dá)某些基因工程產(chǎn)品時(shí)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，

從而有效地降低成本。其中，釀酒酵母是最早用來(lái)作為異源蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)并加以應(yīng)用的酵母系統(tǒng)，然而研究表明，其并不是表達(dá)外源基因的理想宿主菌。直至1969 年，Ogata 等首次發(fā)現(xiàn)一種嗜甲醇酵母—巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris），它可以在甲醇為唯一碳源的條件下生長(zhǎng)，其中，醇氧化酶（Alcoholoxidase，AOX）是甲醇代謝途徑中的第一個(gè)酶，它可以將甲醇氧化成甲醛和過(guò)氧化氫，在以甲醇為唯一碳源的條件下，AOX1 可占到細(xì)胞分泌總

蛋白的30%。經(jīng)過(guò)近幾十年的發(fā)展，目前，巴斯德畢赤酵母已成為最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）具有其他表達(dá)系統(tǒng)所無(wú)可比擬的優(yōu)越性：生長(zhǎng)速度快，表達(dá)量高，能對(duì)外源基因進(jìn)行正確翻譯和修飾，克服了大腸桿菌表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，表達(dá)量低的缺點(diǎn)，也克服了釀酒酵母系統(tǒng)缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率差，表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等缺點(diǎn)并且自身分泌的背景蛋白少，糖基化程度低，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低，可采用廉價(jià)的培養(yǎng)基，可實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵。有研究表明，利用畢赤酵母生產(chǎn)重組蛋白A，經(jīng)68 h 的誘導(dǎo)后，rSPA 產(chǎn)量可達(dá)8.8 g/L，占發(fā)酵液中總蛋白的80% 以上，較大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有明顯提高；通過(guò)對(duì)來(lái)自大腸桿菌和畢赤酵母的rLTB 的特性作了比較，其結(jié)果表明，rLTB 在

畢赤酵母中的表達(dá)量是其在大腸桿菌中的6 倍且具有更高的活性，具有顯著的優(yōu)勢(shì)。正是由于這些優(yōu)點(diǎn)，使得巴斯德畢赤酵母迅速發(fā)展成為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物工程學(xué)等領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。

但是同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，巴斯德畢赤酵母外源表達(dá)系統(tǒng)的不足。在表達(dá)外源蛋白時(shí)，巴斯德畢赤酵母重組菌往往存在比較嚴(yán)重的蛋白降解現(xiàn)象。酵母表達(dá)外源糖蛋白時(shí)會(huì)對(duì)蛋白進(jìn)行過(guò)度N-糖基化修飾，產(chǎn)生高甘露糖型糖鏈，影響蛋白活性，從而限制了巴斯德畢赤酵母表達(dá)人源型蛋白表達(dá)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。只有通過(guò)對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)調(diào)控及翻譯后修飾等機(jī)理有進(jìn)一步的了解，才能夠?qū)ふ页鲆环N有效地通過(guò)相關(guān)基因敲除達(dá)到影響表達(dá)蛋白途徑的方法，實(shí)現(xiàn)改良的畢赤酵母重組菌的構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供一種畢赤酵母高效基因敲除方法，有效改善畢赤酵母對(duì)蛋白的糖基化修飾，解決融合蛋白過(guò)度糖基化的問(wèn)題，對(duì)畢赤酵母och 1基因進(jìn)行了高效敲除。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種畢赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，包含以下步驟：

S1. 通過(guò)質(zhì)粒pYES2構(gòu)建敲除質(zhì)粒pGE1203-ADE-URA3；