[發明專利]一種檢測致病性弧菌的方法

有效

• 申請號: 201810852734.0
• 申請日: 2018-07-27
• 公開（公告）號: CN108841925B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 韓嘉鈺;云振宇;黃盈;吳琦;趙琳;劉菲;周航;彭麗
• 申請（專利權）人: 四川華漢三創生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6837
• 分類號: C12Q1/6837;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 齊云

本發明公開了一種檢測致病性弧菌的方法，涉及致病性弧菌檢測技術。該檢測方法采用如下引物對中的一種或多種的組合進行PCR：SEQ ID NO.1?2、SEQ ID NO.3?4、SEQ ID NO.5?6、SEQ ID NO.7?8、SEQ ID NO.9?10、SEQ ID NO.11?12、SEQ ID NO.13?14、SEQ ID NO.15?16、SEQ ID NO.17?18以及SEQ ID NO.19?20；利用該方法可對常見的致病弧菌如霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創傷弧菌、擬態弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等進行檢測，避免非特異性擴增，具有較強的特異性和較高的靈敏度。

技術領域

本發明涉及致病性弧菌檢測技術領域，具體而言，涉及一種檢測致病性弧菌的方法。

背景技術

食源性疾病是當今世界上最廣泛的衛生問題之一，發病率居人類各種疾病首位，世界衛生組織(WHO)的數據表明，食源性和水源性腹瀉病每年導致約220萬人死亡，其中多數是兒童；在工業化國家，每年有超過30％的人口患有食源性疾病。

致病性弧菌(Pathogenic Vibrio)是一類重要的食源性病原菌，廣泛存在于自然水環境，特別是海水中，對海產品有較大程度的污染。我國沿海省份有著廣闊的海域和豐富的海產品，居民愛吃海產品，歷來有生食或半生食貝類、甲殼類等海產品的習慣。近年來進出口海產品中致病性弧菌的檢出屢見不鮮，致病性弧菌污染引起的食源性疾病爆發已成為突出的公共衛生問題，嚴重危害人民的身體健康并造成經濟財產損失。

致病性弧菌主要包括霍亂弧菌(Vibrio cholerea,V.c)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus,V.p)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus,V.v)、河流弧菌(Vibrioflurialis,V.f)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,V.a)、擬態弧菌(Vibrio mimicus,V.m)等12種。前兩種弧菌危害大、致病率高?；魜y弧菌是一種古老而流行廣泛的烈性病原體之一，被WHO定為國際檢疫菌；近年來以腸道門診監測為基礎的食源性疾病主動監測結果顯示，副溶血性弧菌是導致食源性疾病發病最多的細菌性病原微生物；創傷弧菌、河弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌等致病性弧菌的感染亦十分普遍。報道指出浙江省進口食品被創傷弧菌污染食品引起的食物中毒是最為嚴重的食源性疾患之一，免疫力低下患者致死率達50％～60％；河流弧菌在我國沿海地區海水中檢出率約為6％～15％，海產品中檢出率為4％～5％；溶藻弧菌數量位居海水類弧菌之首，能夠引起食物中毒、中耳炎、敗血癥、腦膜炎等嚴重疾病而未受到重視；擬態弧菌腹瀉癥狀與霍亂弧菌所致腹瀉癥狀極為相似，典型癥狀都是米泔水樣便。

目前致病性弧菌的檢測方法有標準檢測和快速檢測兩種，其中標準方法主要基于生理、生化指標，利用在高鹽條件下產酸、產氣以及生長代謝方面等特性進行鑒定。這些方法操作步驟繁瑣，對操作人員技術水平要求比較高，且檢測的周期長，在相當大的程度上限制了致病性弧菌快速檢測、鑒定的能力。隨著分子生物學技術的發展，許多方法如PCR、酶聯免疫熒光方法、膠體金方法等已經應用到致病性弧菌的檢測中，大大的縮短了檢測的周期。在這些技術的基礎上又開發了AFLP、RFLP等方法。這些檢測方法的建立在一定程度上提高了檢測的效率，縮短了檢測的周期，但是上述技術也存在各自的弊端。如PCR方法易出現污染導致假陽性結果，而且一些陽性結果還需要測序鑒定；酶聯免疫熒光技術存在檢測靈敏度不高等缺點。隨著人民生活水平的提高，消費者對食品衛生提出了更高的標準，單一弧菌的檢測方法已不再適用現今多重檢測的迫切需求。有研究發現創傷弧菌可能與副溶血性弧菌一起通過牡蠣等海水產品復合感染生食者。雖然北歐食品協會的“食品中致病性弧菌的檢測和計數”分別規定了4種致病性弧菌的檢測方法，但仍難以反映海產品被其他致病性弧菌污染的真正狀況。

現在國內關于致病性弧菌的國家標準和行業標準檢測方法僅限于傳統的微生物學檢測方法，每種檢測方法只能檢測一種致病性弧菌。而國外的傳統微生物學檢測方法(如FDA、AOAC、ISO等)也是以檢測單一或少數目標菌為目的設計的程序。每檢測一種致病性弧菌都需配制不同的培養基和試劑，費時費力。