[發明專利]鴨坦布蘇病毒的qPCR檢測方法

在審

• 申請號: 201810851970.0
• 申請日: 2018-07-30
• 公開（公告）號: CN108950071A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 陳國強;時長軍;李永旺;王凱民;張嶸;陳雷;朱婷;陸春華
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國蘇州出入境檢驗檢疫局;蘇州西山生物技術有限公司;江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 馬明渡;楊超

1.一種鴨坦布蘇病毒的引物對，其特征在于：其中一條引物DTMUV-F為針對鴨坦布蘇病毒的E蛋白基因設計的上游引物，該上游引物的序列為5’-GGCAATGGCTGTGGCTTGTT-3’；另一條引物DTMUV-R為針對鴨坦布蘇病毒的E蛋白基因設計的下游引物，該下游引物的序列為5’-TTGTGGTAGGTGCTCGCTTCC-3’ 。

2.一種鴨坦布蘇病毒的qPCR檢測方法，其特征在于：該檢測方法包括以下步驟：

第一步，引物和標準品重組質粒的合成：針對鴨坦布蘇病毒的E蛋白基因設計了權利要求1所述的一對引物，所述引物在DTMUV BYD-1株的靶序列被人工連接到pUC57載體上，形成標準品重組質粒；

第二步，分別以所述標準品重組質粒和待測樣品中的核酸為模板，進行qPCR擴增反應，其中，所述標準品重組質粒的梯度濃度為2.0×10⁸~2.0×10^-1 copies/μL，每個濃度梯度重復3次，qPCR擴增反應的20 μL反應體系為：

2×SYBR? Premix Ex Taq?(TliRNaseH Plus） 10 μL；

50×ROX 0.4 μL；

引物DTMUV-F 20 μM，0.2 μL；

引物DTMUV-R 20 μM，0.2 μL；

去離子水 4.2 μL；

核酸模板 5 μL；

qPCR擴增反應后，采集熒光信號，得到qPCR產物的Ct值并進行熔解曲線分析，當Ct值≤36且Tm值在82.9~83.3之間時，代表生物樣品中含有鴨坦布蘇病毒，為陽性；當Ct值大于36，或者Tm值小于82.9或大于83.3時，代表生物樣品中不含有鴨坦布蘇病毒，為陰性；

第三步，通過所述標準品重組質粒的Ct值和各個梯度濃度建立標準曲線，最后，根據標準曲線和待測樣品的Ct值得到待測樣品的含量。

3. 根據權利要求2所述的鴨坦布蘇病毒的qPCR檢測方法，其特征在于：在所述第二步中，qPCR擴增反應條件為：95℃預變性30 s，之后擴增40個循環，每個循環95℃變性5 s，60℃退火延伸31 s，采集信號；循環結束后65℃~95℃以0.1℃遞增，每個溫度處理5 s，讀值并繪制熔解曲線。