[發明專利]一種獲取重組大腸桿菌中丙酮酸氧化酶的方法

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• 申請號: 201810851942.9
• 申請日: 2018-07-30
• 公開（公告）號: CN108795890A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 張建國;盧俊文
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 郁旦蓉

本發明提供一種獲取重組大腸桿菌中丙酮酸氧化酶的方法，包括如下步驟：將含有丙酮酸氧化酶的表達基因的重組大腸桿菌pET28a?pod接種至固體培養基上進行活化，得到活化的重組大腸桿菌pET28a?pod；將活化的重組大腸桿菌pET28a?pod接種至放于搖床上的LB培養基并進行搖動，得到活化的重組大腸桿菌pET28a?pod的種子液；接種該種子液至TB培養基進行培養，培養至濃度為第一細胞濃度后加入誘導劑進行誘導，當濃度為第二細胞濃度后不斷加入鹽酸溶液進行發酵至pH值為5.5?6.5，然后繼續誘導，得到菌液I；取菌液I進行離心后倒去上清液，用PBS溶液洗滌兩次后用等體積的PBS溶液進行重懸，得到重懸液；對重懸液進行超聲破碎，得到超聲破碎后的菌液II；取菌液II進行離心，收集含有丙酮酸氧化酶的上清液。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種獲取重組大腸桿菌中丙酮酸氧化酶的方法。

背景技術

丙酮酸氧化酶可用于丙酮酸、丙酮酸激酶、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、無機磷、唾液酸、唾液酸激酶以及尿素的檢測，是生化檢測試劑盒中十分重要的組成成分。近年來，有學者報道了可發酵生產丙酮酸氧化酶的野生型菌株，如植物乳桿菌、綠色氣球菌和大腸桿菌。在這些野生型菌株中，來源于綠色氣球菌的丙酮酸氧化酶因其良好的性能被作為生化檢測試劑中的主要成分。但來源于綠色氣球菌的丙酮酸氧化酶的發酵產量較低為120U/L，所以需要開發新技術以提高其產量。

基因工程技術是提高外源蛋白產量的良好選擇。目前報道了一些表達外源蛋白的代表微生物，如巴斯德畢赤酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等。在所有重組微生物中，大腸桿菌因其清晰的遺傳模式、高產量的重組蛋白被認為是表達外源蛋白中最成功的重組微生物。在生產發酵中，重組大腸桿菌具有高生長速率和易于控制培養的優點。因此，將來源于綠色氣球菌中的丙酮酸氧化酶在重組大腸桿菌中表達是很合理的。參見參考文獻1中Zhao等人構建了含有pSML載體的重組大腸桿菌，丙酮酸氧化酶的產量為670U/L。在我們之前的研究中，構建了重組大腸桿菌pET28a-pod，其中包含了進行密碼子優化的丙酮酸氧化酶基因片段，經過誘導劑和溫度優化后，丙酮酸氧化酶的產量達到了4106.9U/L參見參考文獻2。但在擴大培養重組大腸桿菌表達丙酮酸氧化酶時，大量具有活性的丙酮酸氧化酶自發地形成了無活性的包涵體。因此，在后期更高密度培養中，需要降低丙酮酸氧化酶向包涵體變化的過程，最終才能得到高產量的可溶性丙酮酸氧化酶。

參考文獻1：Zhao J,Wang Y,Chu J,Zhang S,Zhuang Y,Yuan Z(2008)Statistical optimization of medium for the production of pyruvate oxidase bythe recombinant Escherichia coli.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 35(4):257-262(Zhao J，Wang Y，Chu J，Zhang S，ZhuangY，Yuan Z(2008)重組大腸桿菌表達丙酮酸氧化酶培養基的統計學優化，工業微生物和生物技術雜志，35(4):257-262)。

參考文獻2：Lu J,Zhao Y,Zhang J(2018)High‐level expression ofAerococcus viridans pyruvate oxidase in Escherichia coli by optimization ofvectors and induction conditions.Lett Appl Microbiol.doi:doi:10.1111/lam.13013(Lu J，Zhao Y,，Zhang J(2018)優化質粒和誘導條件使重組大腸桿菌高效表達丙酮酸氧化酶的研究，應用微生物通訊，doi:doi:10.1111/lam.13013[A1])。

發明內容

本發明是為了解決上述問題而進行的，目的在于提供一直獲取重組大腸桿菌中丙酮酸氧化酶的方法。