[發明專利]一種曇花組培脫毒育苗的方法

在審

• 申請號: 201810851527.3
• 申請日: 2018-07-30
• 公開（公告）號: CN108901851A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 韓佳佳;孔令群;李晶瑤
• 申請（專利權）人: 連云港秀景園林綠化工程有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 長沙新裕知識產權代理有限公司 43210
• 代理人: 趙登高

1.一種曇花組培脫毒育苗的方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

（1）曇花植株的選擇與循環熱處理：

選取生長健壯、無病蟲害的曇花植株，放入培養室內，每日于36～38℃、2000-2200Lux光照條件下培養10～12小時，然后于22~25℃、黑暗條件下培養12~14小時，再回到36~38℃環境，如此循環培養 30~35天；

（2）外植體消毒與莖尖剝離：

取步驟（1）中植株，切取其枝梢含生長點的長 2cm幼嫩莖段，先蘸少量洗滌液用手輕輕搓洗2~3次，再用流水沖洗30~60 min后，將該莖段轉移至超凈工作臺上，首先采用體積分數為75%的酒精消毒3~5min，然后采用質量分數為0.5%的新潔爾滅+2滴S106殺菌劑消毒10min，再采用質量分數為0.6%的鄰苯二甲醛+2-3滴吐溫-80/升滅菌液消毒10min，最后用無菌濾紙吸干表面水分；在無菌操作環境中用解剖刀切取保留自莖尖起0.5cm的莖段，放在0.6%的鄰苯二甲醛中處理20s后，將其放在 75%酒精中消毒處理10s，再用無菌水反復沖洗3遍，瀝干水分；再用滅過菌的刀片、鑷子在無菌培養皿內把其莖段切成0.4~0.5mm的小顆粒，這些小顆粒為莖尖組織；

（3）愈傷組織誘導培養：

將上述獲得的莖尖組織快速接種到愈傷組織誘導培養基中，每個組織培養瓶中放入3~5個莖尖組織顆粒，封好瓶口放入人工氣候培養箱中，培養條件為溫度20~25℃、相對濕度55~65%、1000-1500Lux每天光照10~12小時，培養30~40天可獲得黃綠色顆粒狀的愈傷組織；

（4）愈傷組織分化培養：

將步驟（3）獲得的新鮮愈傷組織在無菌條件下切成大小一致的小塊，轉入愈傷組織分化培養基中繼續培養，培養箱溫度控制為22~26℃、光照強度控制為1000-1500Lux、相對濕度控制為55~65%、每天光照12~14小時，培養13~16天后愈傷組織可陸續分化出叢生的不定芽，再培養18~21天芽苗株高長至2~3cm時即為獲得的試管苗；

（5）病毒檢測：

采用酶聯免疫吸附法（ELISA）對上述獲得的試管苗苗進行病毒檢測，若檢測合格即為曇花脫毒種苗。

2.如權利要求1所述的一種曇花組培脫毒育苗的方法，其特征在于，所述步驟（3）中愈傷組織誘導培養基的配方為：硝酸鉀1850~2000mg/L、磷酸二氫銨120~140mg/L、硫酸鎂310~330mg/L、無水氯化鈣295~315mg/L、碘化鉀0.8~0.9mg/L、硼酸4.0~5.0mg/L、硫酸錳10.0~12.0mg/L、硫酸鋅0.8~1.2mg/L、鉬酸鈉0.12~0.14mg/L、硫酸銅0.23~0.27mg/L、氯化鈷0.09~0.12mg/L、乙二胺四乙酸鐵鈉17.5~19.5mg/L、肌醇90~110 mg/L、維生素B6 0.4~0.6 mg/L、維生素B1 0.2~0.4 mg/L、 維生素 C 0.4~0.6mg/L、煙酸0.2~0.5 mg/L、脯氨酸1.3~1.5mg/L、谷胱甘肽2.7~3.3 mg/L、活性炭 8~11g/L、番茄汁30~40ml/L、核苷0.3~0.5mg/L、三十烷醇0.2~0.4mg/L、萘乙酸0.4~0.6mg/L、激動素1.5~1.7mg/L、β-谷甾醇0.9~1.1mg/L、BAST抗病毒劑0.08~0.11 mg/L、蔗糖25~30g/L、植物凝膠7~10g/L，pH調節為5.6~6.0。