[發明專利]一種牛支原體病PCR快速診斷試劑盒

在審

• 申請號: 201810847415.0
• 申請日: 2018-07-28
• 公開（公告）號: CN109055582A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 楊莉;余波;孫啟躍;余國富;吳位珩;張濤;徐景娥;劉鏡;黃波;馮明祥;姜玲玲;楊茂生
• 申請（專利權）人: 貴州省畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/35
• 代理公司: 貴陽睿騰知識產權代理有限公司 52114
• 代理人: 谷慶紅

本發明涉及病毒核酸檢測領域，具體涉及一種牛支原體病PCR快速診斷試劑盒。本發明的牛支原體病PCR快速診斷試劑盒，包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗劑，200μL PCR酶，140μL DL2000 Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL陽性對照，40μL陰性對照，1200μL TE緩沖液，20個吸附柱；引物濃度為20μM，漂洗劑用時現配，所述上引物的序列為：5’?ACGTGACTACTTCACCCTGAT?3’，所述下引物序列為：5’?TAGACCGACTATTTCACCTTC?3’，它可從牛肺、鼻拭子臨床樣本中直接檢測到牛支原體病病原核酸，試劑盒的靈敏度為1pg，整個檢測過程從開始到出結果僅需3.5小時。本發明的試劑盒具有快速、靈敏性高、特異性強等特點，且不需要考慮菌體死活、抗體產生等因素，對牛支原體感染的診斷、防治與預后評估具有重要意義。

技術領域

本發明涉及病毒核酸檢測領域，具體涉及一種牛支原體病PCR快速診斷試劑盒。

背景技術

牛支原體是危害養牛業的一種重要的致病性支原體，除能導致牛肺炎、乳腺炎、關節炎外，還導致角膜結膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產與不孕等多種疾病。

1961年，美國人Hale首次從患乳腺炎的牛乳中分離得到牛支原體，1976年報道其與牛呼吸系統疾病有關。目前，該病原在世界范圍內普遍存在。歐洲每年約有25％～33％的犢牛肺炎是由牛支原體引起的，相當于每年損失1.44～1.92億歐元，其中英國每年有190萬頭牛患牛支原體肺炎，死亡達15.7萬頭。美國每年由于牛支原體導致的牛呼吸系統疾病和乳腺疾病所造成損失達1.40億美元，牛場感染率可達70％。

在我國，自2008年以來，我國大部分省地區新從外地引進肉牛爆發了以壞死性肺炎為主要特征的“傳染性牛支原體肺炎”疫情，多數牛在運輸到目的地后1～2周左右發病，發病率為50％～100％，病死率高達10％～50％，給我國肉牛養殖業造成了巨大的經濟損失。隨著我國肉牛養殖規模的不斷壯大，北牛南運、北繁南育，引進國外種牛日益普遍，肉牛的各種疾病也隨之而來，肉牛支原體病的發生呈逐年上升趨勢。而大多數的肉牛支原體病伴有多病原混合感染現象出現，臨床上難以及時鑒別診斷，細菌學培養分離鑒定，程序繁瑣、培養周期長，免疫學診斷雖然操作簡單，但具有抗體依耐性，特別是在感染早期，血清中抗體水平低，檢測的敏感性低，達不到早期診斷的目的，延誤防治時機，給肉牛業造成巨大的經濟損失。而PCR診斷技術具有敏感、特異的特點，能快速、準確地檢測病原核酸，且不考慮菌體死活、抗體產生等因素，并可對疾病早期進行診斷，為防治該病爭取到了最佳的治療時機。

因此，尋找一種快速、靈敏性高、特異性強的牛支原體病PCR快速診斷試劑盒是當務之急。

發明內容

為了解決現有技術中存在的上述技術問題，本發明提供一種牛支原體病PCR快速診斷試劑盒，具體是通過以下技術方案得以實現的：

一種牛支原體病PCR快速診斷試劑盒，該試劑盒包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗劑，200μL PCR酶，140μL DL2000Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL陽性對照，40μL陰性對照，1200μL TE緩沖液，20個吸附柱；引物濃度為20μM，漂洗劑用時現配，所述上引物的序列為：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3’，所述下引物序列為：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3’。

所述TBS液，是10mmoL/L的Tris含0.9％NaCL，用1N HCl調pH至7.4。

所述蛋白酶K，用TE溶液配制成20mg/mL的溶液。

所述裂解液，是由10mM Tris-HCL、1mM EDTA、2.5M NaCL以及占裂解液總體積5％的SDS組成的混合溶液。