[發(fā)明專利]一種制備分子生物級牛血清白蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810839672.X
• 申請日: 2018-07-27
• 公開（公告）號: CN108864278B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 時彥祎;楊心意;覃雨棠
• 申請（專利權）人: 珠海寶銳生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 盧澤明

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領域，具體涉及一種制備分子生物級牛血清白蛋白的方法。本發(fā)明制備分子生物級牛血清白蛋白的方法包括吸附劑分散液制備、吸附劑純化牛血清白蛋白樣品、肝素?瓊脂糖層析柱處理牛血清白蛋白樣品、超濾濃縮以及透析處理等步驟。本發(fā)明的方法采用硅藻土與Heparin?sepharose層析柱的結合對牛血清白蛋白樣品進行純化，能夠去除牛血清白蛋白樣品中的核酸酶，得到分子生物級的牛血清白蛋白；整個純化過程都在低溫環(huán)境下進行，最大限度的保持了牛血清白蛋白的活性；并且不涉及DEPC處理，不會對環(huán)境造成污染；可以可完全去除牛血清白蛋白中微量的核酸酶，省時省力且回收效率高，便于放大規(guī)模。

技術領域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領域，具體涉及一種制備分子生物級牛血清白蛋白的方法。

背景技術

核酸酶是一種能催化核苷酸鏈(DNA和RNA)中磷酸二酯鍵水解的酶，作用于磷酸二酯鍵的P-O位置，廣泛存在于動植物體內(nèi)及空氣中。不同來源的核酸酶，其專一性、作用方式都有所不同。只能作用于RNA的稱為核糖核酸酶(RNase)，只能作用于DNA的稱為脫氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶既能作用于RNA也能作用于DNA，因此統(tǒng)稱為核酸酶(nuclease)。根據(jù)核酸酶作用位置的不同，可將核酸酶分為核酸外切酶(exonuclease)和核酸內(nèi)切酶。

由于核酸酶具有很強的降解核酸(DNA及RNA)的能力，因此在以核酸為模板的檢測中，由于存在核酸酶污染很容易出現(xiàn)假陰性結果。另外，核酸酶的耐熱性較好，尤其是RNase酶，即使經(jīng)過高溫處理也仍可能有殘留的活性。通常PCR檢測過程中，對所用水、液體試劑等的滅活主要采用DEPC(劇毒)水浸泡滅活處理，并且之后必須進行高溫高壓降解DEPC處理。牛血清白蛋白(BSA)是一種常用的PCR擴增增強劑和穩(wěn)定劑，它能夠起到穩(wěn)定擴增酶、降低PCR抑制物的作用，減少擴增酶蛋白對容器的吸附等作用。由于BSA生物來源的屬性，必然會殘留一定量的核酸酶；為了避免其蛋白變性，又不能采用劇烈條件對核酸酶進行滅活處理。因此需要一種更有效的去除BSA中核酸酶的方法，以提高BSA在核酸檢測，如PCR檢測中的效果。

硅藻土具有密度小、比表面積大、多孔、吸附性強、耐酸、耐堿、熔點高等特點，主要性質(zhì)如下：(1)硅藻土表面有大量不同種類的羥基，硅藻土中的羥基與其吸附性能直接相關，羥基越多，則吸附性能越好。硅藻土中的羥基在熱處理條件下可以發(fā)生轉(zhuǎn)化，改變硅藻土的吸附性能。此外，這些羥基具有活性，能與其他物質(zhì)發(fā)生反應，改變硅藻土的吸附特性；(2)硅藻土表面的電荷一般為負電荷，使得硅藻土顆粒表現(xiàn)出一定的負電性，在大多數(shù)pH值范圍內(nèi)硅藻土表面都帶負電，能與其他一些帶正電荷的蛋白質(zhì)結合，進而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的純化作用。

由于其廉價、吸附性強、化學性質(zhì)穩(wěn)定等特性，硅藻土已經(jīng)被廣泛應用許多領域。淳俊等人利用硅藻土能有效吸附RNA酶這一特性，開發(fā)了一種廣泛適用的RNA提取方法。結果表明采用硅藻土-苯酚提取方法提取RNA的得率是異硫氰酸胍法的3倍多，而且使用范圍較廣。但是沒有對提取的RNA樣品中殘留的核酸酶進行測試。翟玲等人報道了一種去除牛血清白蛋白蛋白中的RNA酶的方法，采用高嶺土對牛血清白蛋白溶液進行吸附，通過電泳法進行檢測，結果表明，37℃條件下未經(jīng)高嶺土處理的BSA在1個小時內(nèi)沒有表現(xiàn)出RNA酶活性，但2小時后表現(xiàn)出明顯的RNA酶的活性，而經(jīng)過高嶺土處理的BSA在2小時內(nèi)幾乎不水解RNA，但該檢驗方法為電泳法，靈敏度相對較低，微量殘留的核酸酶檢測不到。