[發明專利]基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測探針、檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201810836655.0
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN109055498A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 郭英姝;尚鑫鑫;劉斐;胡銀華;武飛;張書圣
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

1.一種基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測探針，其特征在于，包括環形探針、熒光探針和發卡探針；所述環形探針包括識別序列、配對序列和分子信標結合序列；所述熒光探針，5’端修飾熒光基團Cy5，3’端修飾淬滅基團Dabcyl，熒光探針環區核苷酸序列與環形探針分子信標結合序列相同；所述發卡探針依次包括5’端側鏈(1)、環區(2)以及3’端側鏈(3)；發卡探針環區(2)核苷酸序列與環形探針配對序列相同；發卡探針5’端側鏈(1)與3’端側鏈(3)部分序列互補；

所述環形探針識別序列可特異性識別待分析物堿基序列；配對序列的互補序列可與發卡探針的環區結合，使發卡探針的莖區核苷酸雙鏈打開。

2.根據權利要求1所述的基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測探針，其特征在于，miRNA檢測探針核苷酸序列具體如下：

熒光探針核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；發卡探針核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

生物小分子檢測探針核苷酸序列具體如下：

熒光探針核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；發卡探針核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求1所述的基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測探針，其特征在于，所述環形探針的制備方法，包括以下步驟：

將DNA鏈1，DNA鏈2按摩爾比1:1-1:5混合，在緩沖溶液中80-95℃加熱1-2min，然后緩慢冷卻至室溫；加入T4DNA連接酶，20-25℃下孵育12-15h；60-65℃加熱10-15min使酶變性；加入Exo I、Exo III消化3-5小時，并且通過在80-90℃加熱20-25min使酶變性；離心、過濾、純化即得。

4.一種基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

配置超樹枝狀滾環轉錄體系，及

在25-40℃下恒溫反應75-90min，及

進行熒光檢測；

其中，所述超樹枝狀滾環轉錄體系包含RNA聚合酶、待測miRNA和/或生物小分子樣品，環形探針、熒光探針和發卡探針；所述環形探針包括識別序列、配對序列和分子信標結合序列；所述熒光探針，5’端修飾熒光基團Cy5，3’端修飾淬滅基團Dabcyl，熒光探針環區核苷酸序列與環形探針分子信標結合序列相同；所述發卡探針依次包括5’端側鏈(1)、環區(2)以及3’端側鏈(3)；發卡探針環區(2)核苷酸序列與環形探針配對序列相同；發卡探針5’端側鏈(1)與3’端側鏈(3)部分序列互補。

5.根據權利要求3所述基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測方法，其特征在于，所述RNA聚合酶為T7RNA聚合酶。

6.根據權利要求3所述基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測方法，其特征在于，待測miRNA樣品為合成的miRNA樣品或含有miRNA的細胞樣品；待測生物小分子樣品為合成的生物小分子樣品或含有生物小分子的待測細胞裂解液。

7.根據權利要求3所述基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測方法，其特征在于，所述超樹枝狀滾環轉錄體系中，所述環形探針、熒光探針和發卡探針的摩爾比為：1-5:1-10:1-10。

8.根據權利要求3所述基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測方法，其特征在于，所述生物小分子為還原型巰基化合物，優選的為谷胱甘肽；所述生物小分子超樹枝狀滾環轉錄體系還包括含有二硫鍵的生物素化DNA與鏈霉親和素修飾的磁珠結合。

9.根據權利要求1所述的基于超樹枝狀滾環轉錄反應的miRNA和/或生物小分子檢測探針在制備檢測miRNA和/或生物小分子基因芯片或試劑盒中的應用。

10.一種用于miRNA和/或生物小分子檢測的試劑盒，其特征在于，包括環形探針、熒光探針，發卡探針和RNA聚合酶；

所述環形探針包括識別序列、配對序列和分子信標結合序列；所述熒光探針，5’端修飾熒光基團Cy5，3’端修飾淬滅基團Dabcyl，熒光探針環區核苷酸序列與環形探針分子信標結合序列相同；所述發卡探針依次包括5’端側鏈(1)、環區(2)以及3’端側鏈(3)；發卡探針環區(2)核苷酸序列與環形探針配對序列相同；發卡探針5’端側鏈(1)與3’端側鏈(3)部分序列互補。

優選的，miRNA檢測探針核苷酸序列具體如下：

熒光探針核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；發卡探針核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

優選的，生物小分子檢測探針核苷酸序列具體如下：

熒光探針核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；發卡探針核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述環形探針的制備方法，包括以下步驟：

將DNA鏈1，DNA鏈2按摩爾比1:1-1:5混合，在緩沖溶液中80-95℃加熱1-2min，然后緩慢冷卻至室溫；加入T4DNA連接酶，20-25℃下孵育12-15h；60-65℃加熱10-15min使酶變性；加入Exo I、Exo III消化3-5小時，并且通過在80-90℃加熱20-25min使酶變性；離心、過濾、純化即得。