[發明專利]大田薔薇屬植株上建立病毒誘導基因沉默體系的方法

有效

• 申請號: 201810833152.8
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108866096B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 趙蘭勇;隋曉明;徐宗大;于曉艷;趙明遠;韓旭;王燁楠;王洋;張新鵬;王玉
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 于洪偉

1.一種大田多年生‘紫枝’玫瑰、‘紫龍臥池’玫瑰和山刺玫植株上建立病毒誘導基因沉默體系的方法，其特征在于，通過如下步驟實現：

1）確定接種時期：3月中旬至4月中旬期間，接種時間為下午3點以后，提前查看天氣預報，接種后一周之內確保無降雨；

2）配制侵染液：侵染液現用現配，配制過程如下：

首先，挑取帶有相應病毒質粒的農桿菌陽性克隆于5mlLB或YEB液體培養基中，該培養基中含有kan 50ug/ml、利福平100ug/ml， 28℃條件下， 200r/min震蕩10-12h至渾濁而不泛白；

其次，分別再用50mlLB或YEB液體培養基培養，該培養基中含有kan 50ug/ml、利福平100ug/ml、 MES 10mM、AS 200uM ，28℃條件下震蕩，在菌液濃度達到OD₆₀₀為1.5-2.0時取出；

然后，離心收集菌體，均用25ml侵染緩沖液懸浮菌體，該侵染緩沖液以1/2MS液體培養基作為溶劑，其中含有MES 10mM、AS 100uM、MgC1₂ 10mM，調節菌液濃度OD₆₀₀到1.5-2.0，形成農桿菌侵染緩沖液；

最后，將含有等濃度pTRV1的農桿菌侵染緩沖液分別與含有pTRV2和pTRV2-目的基因片段的農桿菌浸染緩沖液等體積混合，分別在兩種混合好的液體中加入終濃度為0.01%的Silwet-77，黑暗條件下室溫靜置4h，形成兩種農桿菌侵染液；

3）病毒載體的接種：采取鋒利尖銳的器具將擦拭干凈的當年生的整簇的小葉、小葉著生的葉柄以及葉片基部的小枝進行密集劃傷，小葉在背面劃傷，可劃透整個葉面，但不要使其殘缺，葉柄及小枝劃傷力度加大，傷口加深，但不能使其斷裂，劃傷的傷口為斜網格狀交替排列，之后將整簇的小葉及其他有劃傷的部位根據體積大小完全浸沒在盛有侵染液的5ml或10ml離心管中進行侵染，單次侵染10-15min，若天氣較干燥或有風天氣時侵染后的葉片表面水分蒸發較快，可再次侵染2-5min，侵染完畢后掛牌注明處理組別及處理時間；

4）接種后處理：每接種完一組上述小葉、葉柄及小枝，采用大號黑色塑料袋將接種區域連同其所在的整個枝條完全套住并將袋口封緊固定，黑色塑料袋24h之后即可去除，使接種區域接觸正常的自然條件，如遇惡劣天氣，適當延遲摘袋時間；

5）基因沉默效率檢驗：組別包括病毒空載體組、病毒與目的基因復合載體組和 未經處理的空白對照組，首先對上述三組樣本進行表型觀測，其次對所有組別經處理過的相應組織部位的植物材料提取RNA，合成第一鏈cDNA，進行PCR檢測并通過瓊脂糖凝膠電泳進行條帶觀測，以確定TRV病毒和目的基因的存在，最后通過計算PCR檢測的有效數量與處理總數之間的比值來確定此次的基因沉默效率。

2.根據權利要求1所述的一種大田多年生‘紫枝’玫瑰、‘紫龍臥池’玫瑰和山刺玫植株上建立病毒誘導基因沉默體系的方法，其特征在于，步驟3）中采用的器具設置為注射器針頭、細針或刀片。

3.根據權利要求1所述的一種大田多年生‘紫枝’玫瑰、‘紫龍臥池’玫瑰和山刺玫植株上建立病毒誘導基因沉默體系的方法，其特征在于，步驟5）中所有組別樣本的表型觀測具體操作為：自接種第一日起，在根據沉默目的基因的功能所預測的性狀改變發生的日期前后，對基因沉默處理的區域的相關性狀進行不同組別之間的觀測對比，并統計好相應的數量。