[發明專利]表皮干細胞中采用CRISPR-Cas系統進行Rab23基因敲除

有效

• 申請號: 201810830035.6
• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN108893473B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 楊駿;朱成光
• 申請（專利權）人: 浙江玉安康瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 國紅

本發明提供了一種采用CRISPR?Cas系統針對表皮干細胞進行RAB23基因編輯，特別是涉及一種構建RAB23基因敲除的表皮干細胞細胞系的建立，用于皮膚鱗癌的后續研究。其中構建并獲得了一個特異的gRNA，能夠顯著提高表皮干細胞內CRISPR/Cas9針對RAB23的基因編輯效率。本發明提供的表皮干細胞RAB23敲除質粒具有較好的遺傳穩定性以及較高的打靶效率。

技術領域

本發明提供一種采用CRISPR-Cas系統針對表皮干細胞進行RAB23基因編輯，特別是涉及一種構建RAB23基因敲除的表皮干細胞細胞系的建立。

背景技術

表皮干細胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潛能的干細胞，它的正常增殖和分化是維持皮膚及其附屬器(汗腺毛發、皮脂腺)結構和功能完整性的基本要求。在生理條件下，表皮干細胞通過不對稱分裂方式分化為一個干細胞和一個短暫擴充細胞(transit amplifying cellsTA細胞)，TA細胞再經過多次分裂后分化為有絲分裂后細胞(Post-mitotic cells)及終末分化細胞(terminally-differentiatedcells)，以補充表皮細胞不斷更新的需要。研究表明表皮干細胞不僅能在體外長期傳代培養，并保持其增殖分化潛能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，10：45-54.Papini etal.stem cells，2003，21：481-494)，而且，在一定環境條件下還表現出與胚胎干細胞相似的分化潛能[Liang et al，stem cells，2002：20：21-31]。因此，獲得純化的表皮干細胞不僅可為構建有生理功能的人工皮膚提供種子細胞，而且可用于基因治療和轉基因動物的生產。

人類多能干細胞(Human pluripotent stem cells,hPSCs)和基因組編輯技術結合所建立的細胞模型，為疾病研究提供了一個獨特的實驗平臺。利用這個平臺體系，研究人員可以研究特定基因突變甚至染色體結構變異對人類多種細胞類型和組織器官功能的影響及其詳細的分子機制，并可建立攜帶不同遺傳突變的“個性化”疾病模型用于大規模藥物篩選。該模型體系的建立得益于基因組編輯技術，尤其是CRISPR/Cas9(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9,CRISPR/Cas9)技術的飛速發展。

Rab23是RAS原癌基因成員，其編碼的蛋白是小GTP酶超家族Rab家族成員，其突變可引起小鼠開腦綜合征(open brain syndrome)，因此又稱為opb基因。2001年，Eggenschwile:等研究發現，Rab23是Sonic Hedgehog信號通路必要的負調控因子，而近幾年，Rab23作為原癌基因的作用越來越被學者重視。研究發現，Rab23參與肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、和甲狀腺癌的發生發展，并在胃癌中首次發現與腫瘤侵襲密切相關。

其中特別是皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,c SCC)是一種起源于表皮、皮膚附屬器、以及復層扁平上皮角質形成細胞的惡性腫瘤,發病占皮膚惡性腫瘤的16％,僅次于基底細胞癌,光線性角化病、鮑溫病及角化棘皮瘤均能導致角質形成細胞的惡性增殖。c SCC具有侵襲性,可發生早期轉移。因此,鱗狀細胞癌的高轉移、易侵襲性是威脅全球人民的公共健康問題,進一步研究皮膚鱗癌侵襲機制,轉移以及增值的分子機制,具有重要的價值和深遠的意義。而Rab23在鱗癌中高表達,且與鱗癌分化負相關；Transwell實驗證實Rab23顯著促進鱗癌細胞侵襲,并調控侵襲關鍵分子Rac1的表達。

基于表皮干細胞的多能性，為了研究敲除RAB23基因的表皮干細胞在皮膚鱗狀細胞癌治療方面的功能，建立敲除RAB23基因的表皮干細胞細胞系變得尤為重要。

發明內容