[發(fā)明專利]一種檢測動物肌肉組織中喹乙醇代謝物及卡巴氧代謝物含量的方法及其樣品前處理方法

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• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN108918748A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 嚴華;崔鳳云;李建輝;張朝暉;韓深;何悅;齊鶴鳴
• 申請（專利權(quán)）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 白鳳瑩

本發(fā)明公開一種檢測動物肌肉組織中喹乙醇代謝物及卡巴氧代謝物含量的方法及其樣品前處理方法。本發(fā)明首先公開了檢測動物肌肉組織中喹乙醇代謝物及卡巴氧代謝物含量的樣品前處理方法，包括：取待測動物肌肉組織樣品，加入鹽酸溶液進行酸解后，加入乙酸乙酯對喹乙醇代謝物及卡巴氧代謝物進行提取，得到混合液；向混合液中加入MgSO₄和NaCl，渦旋，離心，收集上層得上清液；上清液經(jīng)濃縮、復(fù)溶后，加入甲醇飽和正己烷溶液，渦旋，離心，收集下層溶液，過濾，即得待測溶液。本發(fā)明還公開了樣品經(jīng)前處理后通過液?質(zhì)聯(lián)用檢測喹乙醇代謝物及卡巴氧代謝物含量的方法。本發(fā)明方法耗時短、步驟簡單、重復(fù)性好、結(jié)果準確度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品檢測領(lǐng)域。更具體地，涉及一種檢測動物組織動物肌肉 組織中喹乙醇代謝物及卡巴氧代謝物含量的方法及其樣品前處理方法。

背景技術(shù)

喹噁啉類藥物是一類化學(xué)合成類的抗菌促生長劑，主要包括喹乙醇、卡巴 氧、喹烯酮、乙酰甲喹等藥物。20世紀80年代以來，喹噁啉類藥物作為一種 比較理想的飼料添加劑，在家畜和家禽等的飼料中被廣泛應(yīng)用。動物使用喹噁 啉類藥物后，可提高飼料的轉(zhuǎn)化效率，令蛋白質(zhì)的同化速率加快，使動物體內(nèi) 氮的貯存含量更高，使細胞形成加速、體內(nèi)組織增大，加快長肉速率。但過量 使用此類藥物也會產(chǎn)生一些毒害作用，如DNA致突變和損傷，破壞細胞抗氧 化作用系統(tǒng)，引起細胞自由基的產(chǎn)生，引起細胞周期阻滯和細胞凋亡。動物實 驗發(fā)現(xiàn)喹噁啉類藥物對腎上腺肝臟、脾臟和睪丸均有損傷作用。人類食用含有 喹噁啉類藥物殘留的動物肌肉組織后，也會產(chǎn)生一定的危害。由于喹乙醇的毒 副作用較強，中國在1997年禁止了喹乙醇在禽類養(yǎng)殖中的應(yīng)用。2000年版獸 藥典中規(guī)定喹乙醇只能用于幼豬，禁用于禽和體重超過35千克的豬，休藥期 35天；2005年版獸藥典中規(guī)定喹乙醇禁用于魚類。然而，由于喹噁啉類藥物 的藥效顯著、價格低廉且能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益，因此在中國畜牧生產(chǎn)過程 中仍存在大量使用此類藥物的情況。

喹噁啉類藥物經(jīng)脫單氧、脫雙氧后主要生成喹噁啉-2-羧酸 (quinoxaline-2-carboxylic acid,QCA)或3-甲基喹噁啉-2-羧酸 (3-methyl-quinoxaline-2-carboxylicacid,MQCA)。研究表明，MQCA是喹乙 醇在動物體內(nèi)代謝后的主要產(chǎn)物，QCA是卡巴氧在動物體內(nèi)代謝后的主要產(chǎn) 物，且該產(chǎn)物在動物體內(nèi)滯留時間較長。因其含量與總殘留關(guān)系穩(wěn)定，所以 MQCA和QCA能反應(yīng)殘留總量。國際聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)/世界衛(wèi)生組織 (WHO)食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)于1995年將MQCA和QCA 確定為喹噁啉類獸藥的殘留標示物和監(jiān)控對象。2003年，中國農(nóng)業(yè)部也規(guī)定肌 肉和肝臟組織中MQCA的最大殘留限量分別為4μg/kg和50μg/kg。

中國國家標準GB/T 20746-2006《牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及 代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定的方法包括以下步驟：(1) 樣品酶解：稱取5.00g樣品，加入10mL0.6％甲酸溶液，47℃振蕩水浴1h， 加入3mL Tris堿溶液，再加入0.3mL0.01g/mL蛋白酶水溶液，在47℃振蕩水 浴中酶解16-18小時。加入20mL 0.3mol/L鹽酸，振蕩5min，在5000rpm離 心15min,取上清液過濾。(2)樣品凈化：取濾液過Oasis MAX固相萃取柱， 3次3mL甲醇、3mL水、3次3mL0.1mol/L鹽酸溶液和兩次3mL甲酸水溶液 (1:4)分別淋洗萃取柱，真空抽干后再用2mL乙酸乙酯淋洗，棄去淋洗液， 用3mL2％甲酸-乙酸乙酯溶液洗脫3-甲基-喹噁啉-2-羧酸，45℃氮吹濃縮至干， 1mL0.1％甲酸-甲醇溶液定容，過0.2μm微孔濾膜，供進樣測定。(3)液相色 譜-質(zhì)譜測定。GB/T 20746-2006所規(guī)定的前處理方法經(jīng)過酶解、酸化、SPE凈 化等多個步驟，前處理耗時長，處理一個樣品需要兩天的時間。

針對在檢測喹乙醇代謝物及卡巴氧代謝物時的樣品前處理步驟復(fù)雜的問 題，亟需開發(fā)出一種新的適用于檢測動物肌肉組織中喹乙醇代謝物及卡巴氧 代謝物含量的樣品前處理方法，尤其是適用于液-質(zhì)聯(lián)用檢測的高效靈敏的樣 品前處理的方法。