[發(fā)明專利]一種蘋果中蠟質(zhì)合成相關(guān)基因MdCER1的克隆及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN108823220B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李媛媛;郝玉金;齊晨輝
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/11;A01H5/08;A01H6/20;A01H6/74;A01H6/46;A01H6/00
• 代理公司: 煙臺上禾知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37234
• 代理人: 劉志毅

本發(fā)明涉及一種蘋果中蠟質(zhì)合成相關(guān)基因MdCER1的克隆及其應(yīng)用，所述MdCER1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用強啟動子驅(qū)動原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將MdCER1基因的超量表達載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。本發(fā)明首次通過植物基因工程技術(shù)改善植物表皮蠟質(zhì)含量和抗旱性等性狀，獲得了從蘋果中分離克隆出的蠟質(zhì)相關(guān)基因MdCER1完整編碼區(qū)段的DNA片段，并發(fā)現(xiàn)在MdCER1基因超量表達的轉(zhuǎn)基因材料蠟質(zhì)含量明顯增高，表皮的通透性降低，對ABA更敏感，抗干旱能力明顯提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蘋果中蠟質(zhì)合成相關(guān)基因MdCER1基因及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

我國蘋果的栽培面積、總產(chǎn)量和出口量均居世界首位，是世界最大的蘋果生產(chǎn)、出口和消費國。近年來，隨著生活水平的提高，人們對果品的消費需求也發(fā)生了從數(shù)量到質(zhì)量的轉(zhuǎn)變，提高果實外觀品質(zhì)已成為當前國內(nèi)果品生產(chǎn)上迫切需要解決的重要問題之一。

果實表皮蠟質(zhì)作為其與外界的第一道屏障，具有保護果實免受外界生物以及非生物侵害、阻止組織內(nèi)水分的非氣孔性散失、維持植物表面清潔、減少污染物滯留沉積以及使其表面具有防水等作用。同時，蠟質(zhì)決定了蘋果的光澤品質(zhì)。

大部分蠟質(zhì)位于外角質(zhì)層，多呈現(xiàn)出綠灰色或灰白色。角質(zhì)層蠟質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)決定了其功能對植物生命活動的重要性。它限制了非氣孔性的水分散失，降低紫外線輻射損傷，還通過降低植物表皮的水分含量減少了灰塵、花粉和大氣污染物的沉積。此外，表皮蠟質(zhì)還被認為在抵抗細菌和真菌病原體的侵害方面起到重要作用，并且還參與了植物與昆蟲的相互作用。鑒于角質(zhì)層蠟質(zhì)在植物抗逆境方面的重要作用，越來越多的研究開始關(guān)注這一領(lǐng)域。

植物外層蠟質(zhì)主要由特長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)及其衍生物組成,主要包括醛、烷烴、酮、初級醇、次級醇、酯等,還含有一些三萜類和小分子次級代謝物。研究發(fā)現(xiàn)，CER基因與植物角質(zhì)層蠟質(zhì)形成密切相關(guān)。例如，水稻中wax crystal-sparse leaf4(WSL4)基因，是擬南芥CER6的同源基因，能夠影響蠟的組分。在wsl4-1和wsl4-2突變體中，超過30C的蠟組分含量是顯著減少的。OsCER2是WSL4的輔因子，也是擬南芥CER2的同系物。研究表明WSL4參與超過C22的VLCFA延伸并且超過C24的延伸需要OsCER2的參與，這些結(jié)果表明，WSL4和OsCER2的功能組合式延伸C24-C30脂肪酸所必需的。AtCER17編碼ACYL COENZYME A DESATURASE LIKE4(ADS4)，能夠參與不飽和蠟質(zhì)組分不飽和脂肪醇的合成，并且能夠參與擬南芥花序莖表皮角質(zhì)cutin單體的合成以及角質(zhì)結(jié)構(gòu)的合成，尤其是花序莖頂端。

隨著人們對蘋果品質(zhì)的要求越來越高，品種的改良問題成為科研工作者的一項重要任務(wù)，因此蘋果育種在世界各國果樹研究工作中不斷得到加強。但是，蘋果為多年生木本植物，通過常規(guī)育種選育抗性品種周期長。本發(fā)明為果樹育種提供了一種新的、快速的途徑，尤其是在轉(zhuǎn)基因蘋果砧木和品質(zhì)改良中，MdCER1基因的發(fā)掘不僅能為蘋果抗逆基因工程和品質(zhì)改良提供新的候選基因，豐富植物抗逆基因工程理論體系，而且對于培育其它植物的抗逆種質(zhì)材料(包括一年生植物和多年生木本植物)也具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克隆出一種蘋果中調(diào)控蠟質(zhì)合成相關(guān)基因MdCER1，并驗證其功能。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，公開了一種蘋果中調(diào)控蠟質(zhì)合成的MdCER1基因及其應(yīng)用，其完整編碼區(qū)段的DNA片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本發(fā)明公開了一種蘋果MdCER1基因的克隆方法，包括以下步驟：

(1)提取‘Gala’蘋果組培葉片中的RNA及反轉(zhuǎn)錄；